AFB的金胺罗丹明染色：原理,程序,报告和局限性

涂片显微镜检查是目前检测临床标本中的抗酸快速芽孢杆菌（AFB）的最简单，最快的方法。最常用的定型技术涉及经典的Ziehl-Neelsen（ZN）染色方法或其中之一。如今，这些方法已经被更敏感的金胺-若丹明荧光染色技术所取代，该技术也被称为耐酸染色的Truant方法。

AFB的AURAMINE-RHODAMINE染色原理

金胺和若丹明是对耐酸生物具有亲和力的非特异性荧光染料。在分枝杆菌的情况下，染料可以与细胞壁中所含的分枝酸特异性结合，从而允许污渍渗透。该复合物可抵抗由酸-醇脱色剂溶液引起的脱色。

复染剂高锰酸钾有助于防止非特异性荧光，从而减少了伪影的可能性。当在紫外线照射下在显微镜下观察时，耐酸性细胞为黄色或明亮的橙色，深色背景。

所需试剂

原色（Auramine罗丹明染色）：将

1.5 g Auramine O和0.75 g Rhodamine B溶解在75 ml甘油（甘油），10 ml加热的酚晶体和50 ml蒸馏水的溶液中。通常通过通过玻璃棉过滤来清除该溶液。 • 脱色剂（酸性酒精）：

小心地将0.5 ml的浓盐酸添加到100 ml的70％乙醇中。 • 防污剂（高锰酸钾）：将

0.5 g高锰酸钾（KMn04）溶解在100 ml蒸馏水中。

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AFB的AURAMINE-RHODAMINE染色步骤

1.

1. 使载玻片穿过本生灯的火焰或在65-75 C的温度下使用载玻片加热器，以薄薄地涂

抹待研究的材料并进行热固定。请勿过热。

2. 用Auramine O-若丹明B溶液冲洗涂片，并使其染色15分钟，确保染色溶液仍留在

涂片上。请勿加热涂抹。

3. 用无氯水冲洗涂片，直到废水中没有颜色。氯可能会干扰荧光；因此，请用蒸馏水

或去离子水冲洗。

4. 用脱色剂冲洗涂片2至3分钟，然后用蒸馏水洗涤。 5. 用酸性酒精涂满污渍，然后脱色2分钟。

6. 用蒸馏水彻底冲洗载玻片，并甩掉多余的液体。

7. 用高锰酸钾冲洗涂片2分钟。时间对于高锰酸钾至关重要，因为较长时间的反染可

能会淬灭耐酸杆菌的荧光。

8. 用蒸馏水彻底冲洗并风干。不要弄脏。

尽快使用荧光显微镜进行显微镜检查。使用20倍或40倍物镜进行筛选，并使用100倍油浸物镜观察荧光生物的形态。

如果需要，可以使用其他耐酸染色剂（Ziehl-Neelsen或Kinyoun染色剂）之一直接保留玻片。

牛磺酸-若丹明染色的解释

阳性测试：耐酸生物在深色背景下发出黄色或亮橙色荧光。（颜色可能会因所使用的过滤器系统而异）

• 阴性测试：非耐酸生物不会发荧光或可能会显示淡黄色，与明亮的耐酸生物截然不

同。

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AURAMINE-RHODAMINE染色涂片报告 报告在特定放大倍数下对耐酸生物体呈阴性的涂片检查前要检查的最小字段数如下：

放大 200倍 250倍 400倍 450倍 场数 30 30 55 70 涂片报告：

如果未看到荧光棒，则将涂片报告为“ AFB NOT SEEN”。

• 如果看到荧光AFB，则将涂片报告为AFB阳性，并指出加号（1+至4+）中存在的

细菌数量，如下所示：

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看到的AFB数量（450倍放大率） 每70场0 AFB 每70场1-2 AFB 看到的AFB数量（250倍放大率） 每30场0AFB 每30场1-2 AFB 报告为 找不到AFB 用另一个标本重复 1+ 2+ 3+ 4+ 每50场2-18 AFB 每10场4-36 AFB 每场4-36 AFB 每场> 36 AFB 每10场1-9 AFB 每场1-9 AFB 每场10-90 AFB 每场> 90 AFB AURAMINE-RHODAMINE STAIN的局限性 1. 阳性染色反应提供了分枝杆菌存在的推测证据。染色反应为阴性并不表示标本在文化上为阴性。因此，必须采用文化方法。 2. 大多数速生菌株可能不会出现荧光。

3. 建议使用Ziehl-Neelsen染色确认所有阴性荧光涂片。报告为阴性之前，至少应检查

100个。

4. 像Auramine-Rhodamine之类的试剂可能是致癌物，酸-alcoholand高锰酸钾对皮

肤，眼睛和呼吸系统也有强烈刺激性。

5. 使用此类试剂进行处理和染色时需要小心。 6. 过度暴露于复染可能会导致荧光生物失去光泽。

7. 污渍中可能会出现浑浊，但不会干扰污渍的有效性。使用前先摇晃瓶子。 8. 由于荧光褪色的可能性，应在染色后24小时内观察染色的涂片。