ｔｔａｉｎａｎ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇ．２０１５，Ｖｏｉ．２６，Ｎｏ．１６ 海南医学２０１５年８月第２６卷第１６期 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—６３５０．２０１５．１６．０８４７ ・论 著・ 海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究 刘腾，符乃光，李泽友 （海南医学院药学院，海南 海口５７１１９９） 【摘要】 目的分析海南水蛭的品种及其中水蛭素的抗凝作用。方法观察海南水蛭的形态特征、薄层色 谱图，并采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。结果海南水蛭为菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分别为：全身 １ １７４．８ Ｕ／ｇ、头部６ ５２１．７ Ｕ／ｇ、身体３０８．６ Ｕ／ｇ。结论海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得进一步研究开发。 【关键词】海南水蛭；水蛭素；薄层色谱；凝血酶 【中图分类号】Ｒ２８２．７４ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１００３－－－６３５０（２０１５）１６—２３４５—ｏ３ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｉｒｕｄｉｎ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ ｌｅｅｃｈ．ｕＵ Ｔｅｎｇ，ＦＵ Ｎａｉ－ｇｕａｎｇ，ＬＩ Ｚｅ－ｙｏｕ．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐ｝汜ｒｍａ￣ｙ，ＨａｉｎａｎＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｗｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１９９．Ｈａｉｎａｎ，ＣＨｌＮＡ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｅｆｉｖｅ Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ ｌｅｅｃｈｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌｎａｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｉｍｄｉｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ刃ｌ。ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｉｎ．１ａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ ｌｅｅｃｈ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ 刀，ｅｎ ａｎｔｉ． ｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉ￣ａｆｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｈａｉｎａｎ ｌｅｅｃｈｅｓ ｗｅｒｅ Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａ． ｎｉｌｌｅｎｓｉｓ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＨａｉｎａｎ Ｌｅｅｃｈ ｈｉｒｕｄｉｎ Ｗａｓ ｌ １７４．８ Ｕ／ｇ ｏｆｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ，６ ５２１．７ Ｕ／ｇ ｏｆｔｈｅ ｈｅａｄ ｎａｄ ３０８．６ Ｖ／ｇ ｏｆｔｈｅ ｂｏｄｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｈａｉｎａｎ ｌｅｅｃｈｅｓ ｈａｖｅ ｖｅｒｙ ｇｏｏｄ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｄｅｓｅｒｖｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎａｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈａｉｎａｎ ｌｅｅｃｈ；Ｈｉｒｕｄｉｎ；Ｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ＴＬＣ）；Ｔｈｒｏｍｂｉｎ 中药水蛭具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血 们对海南野生水蛭进行鉴别及体外抗凝活性测定，以 脂等多种药理活性，临床上用于治疗多种疾病 】。 探讨海南野生水蛭作为一种抗凝抗栓药物的运用前 ２０１０年版《中国药典》一部中记载水蛭的品种为“水 景，为海南水蛭的养殖、开发和应用打下理论基础。 蛭科动物蚂蟥ＩＶ．Ｐ Ｗｈｉｔｍａｎ、水蛭且ｎｉｐｐｏｎｉｃａ １试剂与仪器 Ｗｈｉｔｍａｎ或柳叶蚂蟥ＩＶ．ａｃｒａｎｕｌａｔａ ｗｔｉｆｔｍａｎ的干燥全 １．１材料与试剂 海南野生水蛭（海南屯昌县 体”［２］。蚂蟥与柳叶蚂蟥经现代研究均含有水蛭素 水田抓获），干燥宽体金线蛭（海南国瑞堂中药制剂有 （Ｈｉｒｕｄｉｎ，一种多肽），具有一定的临床疗效 ，但二者 限公司，产地：广西，杨卫丽副教授鉴定），广西菲牛蛭 临床疗效均不如吸血水蛭Ⅲ，吸血水蛭在我国产量相 粉末（养殖户赠送）。人纤维蛋白原（博雅制药，规格 对丰富，是不错的药材资源。菲牛蛭（Ｐｏｅｃｉｌｏｂｄｅｌｌａ ０．５ 瓶，批号：２０１３ １２２０），凝血酶冻干粉（湖南一格制 ｍａｎｉｌｌｅｎｓ）是一种吸血水蛭，又称马尼拟医蛭，俗称金 药，规格５００单位，批号：１２１１１２－４），三羟甲基甲烷（西 边蚂蟥。从菲牛蛭中分离出的生物活性成分菲牛蛭 亚试剂，批号：Ｂ９２４０７），其他试剂均为分析纯。 素（Ｂｕｆｒｕｄｉｎ）也是一种多肽，由６０多个氨基酸组成，分 １．２ 仪器 冷冻干燥器（ＣＨＲＩＳＴ、型号： 子量７ ０００ Ｄａ，氨基酸残基序列有５０％￣６０％与水蛭 ＡＬＰＨＡ１－２ＬＤ Ｐｌｕｓ），粉碎机（黄城，永康市天祺盛世 素相同。它的作用机理与水蛭素、森林山蛭素 工贸有限公司），ＫＱ２２００Ｅ医用超声波清洗仪（昆山市 （Ｈａｅｍａｄｉｎ）相同，都是抑制凝血酶嘲。张彬等 对菲牛 超声仪器有限公司），飞鸽牌系列ＴＧＬ一１６Ｇ离心机 蛭的抗凝血作用的研究表明菲牛蛭具有较强的体外 （上海安亭科学仪器厂），电热恒温水浴锅（天津市泰斯 抗凝血酶活性，且人工养殖对菲牛蛭的抗凝活性未产 特仪器有限公司、型号：ＤＫ＿９８一Ⅱ），精密ｐＨ计 生不利影响。 （ＰＨＳ－２Ｃ，上海大普仪器有限公司）。 随着水蛭临床应用的广泛，医药市场对水蛭的需 ２方法与结果 求量越来越大，进而对水蛭进行相关研究的文献也越 ２．１海南野生水蛭的鉴别 来越多，尤其是对广西菲牛蛭的研究。菲牛蛭生活于 ２．１．１形态特征个体狭长且扁平，活的背面 水田、水沟或池塘里，主要吸食人、畜血液，造成严重危 呈黄褐色，背中有一条不显著地断裂的蓝灰色纵 害，是海南岛水田的优势种，密度很大【 。海南地区温 纹，个体较大，进食前最大的体长约１１０ｍｉｌｌ，最大 湿度条件非常适合水蛭的生长，水蛭分布密度较广，但 体宽１２ ＩＩｌＩＩ１，尾部明显小于体宽，尾吸盘背面有分散 至今还没有对海南野生水蛭研究的相关文献，因此，我 的不规则色斑，体正侧面各有一条橙黄色的纵带。腹 基金项目：海南医学院大学生创业项目（编号：ＨＹＣＸ２０１２４０） 通讯作者：李泽友。Ｅ—ｍａｉｌ：／ｚｙ７３０７＠１２６．ｃｏｒｎ 海南医学２０１５年８月第２６卷第１６期 Ｈａｌｎａｎ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇ．２０１５，Ｖｏｉ．２６，Ｎｏ．１６ 面淡灰色，无斑点及纵纹。 氨基甲烷盐酸缓冲液。 ２．１．２干燥粉碎将活水蛭室温下加入一定量 ２．２．３凝血酶滴定液的配制 将１ ００ ＮＩＨ／ｍｌ的 生理盐水，浸泡３０ ｍｉｎ后蒸馏水充分清洗，一８０℃低 凝血酶加入不同体积的０．９％氯化钠溶液，配成不同 温冰箱迅速冻死，后将其放置在零下１５℃～２０℃的冷 浓度的凝血酶滴定液。 冻冰箱中进行预冻４８ ｈ，至其周围的冰霜有约５ ｍｎｌ ２．２．４抗凝血活性测定分别精密量取水蛭的全 厚，然后将其迅速放置于真空冷冻干燥设备中，干燥 身、头部和身体提取液１００ ｌ，置试管（１０ ｍｍ￣１００ ｍｍ） １２ ｈ。干燥后的水蛭粉碎处理，得粉末备用。 中，加入含０．５％（人）纤维蛋白原２００ ｌ，摇匀，置水浴 ２．１－３ ＴＬＣ鉴别哺 （１）供试液的制备：取上述水 （３７￣０．５）℃中缓缓滴加凝血酶溶液（５ ｇＦｍｉｎ，对照液 蛭粉末约１００ ｍｇ，加入１ ｍｌ生理盐水，超声波提取 用２ ｇｌ／ｍｉｎ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝 ３０ ｍｉｎ，离心１０ ａｒｉｎ（１ ０００ ｒ／ｍｉｎ），取上清液在８０℃水 血酶溶液的体积。 浴加热２ ｍｉｎ备用，用１ ｍｌ生理盐水做同样处理作为 按下式计算含量：Ｕ＝Ｃ。×Ｖ。／（Ｃ ￣Ｖ２×、 式中：Ｕ为 空白溶液。（２）层析板处理：取硅胶Ｇ板，１０５ｑＣ活化 每１ ｇ含凝血酶活性单位（Ｕ／ｇ）；Ｃ 为凝血酶溶液的浓 ｌ ｈ。（３）薄层条件：将一定量的样品溶液和空白溶液 度（Ｕ／ｍ１）；Ｃ：为供试品溶液的质量浓度（ｇ／ｍ１）；Ｖ 为消 分别用微量注射器点于同一薄层板上，用正丁醇一冰乙 耗凝血酶溶液的体积（ １）；Ｖ：为供试品溶液的加入量 酸一水（３．５：２：４．５）为展开剂，立式上行展开１２ ｃｍ，取出， （ １）；Ｗ为取样量，抗凝活性测定，见表ｌ。 挥去溶剂后喷洒０．２％茚三酮丙酮溶液，在１ ０５ Ｃ下加 热１５ ｍｉｎ，显出紫红色斑点，如图１。由海南水蛭的形 表１海南水蛭的抗凝活性测定结果 态特征和薄层图谱显示可知，海南水蛭是菲牛蛭。 ３讨论 ３．１ 色谱条件的优化参考丁家欣等 的薄层 色谱条件，海南水蛭的图和广西菲牛蛭的图几乎一 致，但和宽体金线蛭的色谱图区分度也不高。多次实 验显示菲牛蛭有时会在溶剂前沿出现一个黄棕色斑 点和在比移值为０．８１左右出现一个很微弱很淡的浅 紫色斑点；但即使在相同的条件下重复试验，这两个 斑点也是时有时无，出现的概率大约为３０％。故此， 图１水蛭的薄层色谱 我们对条件进行了改进，把提取的ＴＬＣ供试液均在 注：Ａ．Ｂ：宽体金线蛭；ｃ：海南水蛭；Ｄ：广西菲牛蛭 ８０￣Ｃ的水浴中加热２ ｍｉｎ，然后进行展开显色，色谱图 ２．２凝血酶滴定法测定抗凝活性 的斑点则表现出较高的区分度。在对提取液加热的 ２．２．１提取液的制备分别精密称取水蛭的全 过程中，宽体金线蛭提取液出现少量白色沉淀，溶液 身和各自的头部及身体粉末各约１ ｇ，精密加入 未变色，菲牛蛭提取液从黑褐色变成棕褐色，且出现 ０．９％氯化钠溶液１０ ｍｌ，充分搅拌，浸提３０ ｍｉｎ，并时 大量沉淀。但加热后的上清液均不影响点样和显色。 时振摇，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，分离上清液，用 ３．２薄层色谱的区别在ＴＬＣ图谱中，菲牛蛭 １．０ｍｏｌ／ＬＮａＣ１溶液调节其ｐＨ值为５．０ 】，备用。 在前沿有一棕黄色斑点，Ｒｆ ０．９５左右，宽体金线蛭 ２．２．２缓冲液的配制取０．２ ｍｏｌ／Ｌ三羟甲基氨 无。而宽体金线蛭在Ｒｆ ０，６２左右有一深紫色斑点， 基甲烷溶液２５ ｍｌ与０．１ ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液４０ ｍｌ，加水 菲牛蛭无，可以区别两种水蛭品种。 至１００ ｍｌ，调节其ｐＨ值为７．４，加入０．５ ｇ（人）纤维蛋 ３＿３活性测定的条件及优化抗凝活性测定 白原溶解，即得含０．５％（人）纤维蛋白原的三羟甲基 时，ｌ ｇ水蛭粉用１０ｍｌ０．９％ＮａＣＩ提取和１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ ・２３４６・ ［］］［ａｆｎａｎ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇ．２０１５，ＶｏＬ ２６，Ｎｏ．１６ 海南医学２０１５年８月第２６卷第ｌ６期 ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００３—６３５０．２０１５．１６．０８４８ 兔短阵室性心动过速心肌病模型的建立 曾向辉 ，周小华。，孙翔’，凌静。，卿艳云 ，张翼 （１．长沙市中医医院（长沙市第八医院）心内科，湖南 长沙４１０１００； ２．湖南师范大学第一附属医院心内科，湖南 长沙４１０００５） 【摘要】 目的探讨建立兔短阵室性心动过速心肌病模型方法。方法 １５只雄性新西兰兔。在元ｘ线、微 创、静脉下用标测电极行短阵室速刺激右心室建立心动过速性心肌病动物模型。用１０极冠状窦电极，经改良５Ｆ 桡动脉鞘，经右侧前腔静脉送至右心室，连接程序刺激仪，起搏右心室。结果起搏１周后心脏彩超检查证实左 心室舒张末内径扩大，左心室射血分数降低，血清Ｂ型脑利钠肽０３ＮＰ）、基质金属蛋白酶９（ＭＭＰ－９）升高、金属蛋 白酶抑制剂ｌ（ＴＩＭＰ一１）下降。ＨＥ染色显示心肌结构排列紊乱，细胞间质炎性浸润。电镜下显示线粒体肿胀，甚 至溶解、破坏，ｚ线模糊，闰盘结构显示不清。３周后再复查心脏彩超、血清ＢＮＰ、／ＶｌＭＰ一９、ＴＩＭＰ一１，心脏射血分数 ０３Ｆ）、短轴缩短率（ＦＳ）Ｊ￣２大致恢复起搏前水平。结论元ｘ线、微创静脉下用标测电极行短阵室速刺激右心室建 立心动过速性心肌病动物模型简单可行。 【关键词】心动过速性心肌病；短阵室性心动过速；Ｂ型脑钠肽；兔；模型 【中图分类号】Ｒ－３３２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】 ｌｏ０３—６３５０（２０ｌ５）ｌ６＿－２３４７—ｏ４ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｎｏｎｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ． ｚＥＮＧ Ｘ／ａｎｇ—－ｈ ｌ，ＺＨｏＵ Ｘｉａｏ－ｈｕａ １，ｓＵＮ Ｘｉａｎｇ１，ＨＮＧ．１ｉｎｇｌ，ＱｍＣ Ｙａｎ－ｙｕｎ １．ｚＨＡＮＧ Ｙｔ ２．１．Ｔ Ｈｏ￣ｉｔａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｗｉｎｅ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈａ 。毋 Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈａ），Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１００，Ｈｕｎａｎ，ＣＨＩＮＡ；２． ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ＦｉｒｓｔＡｆｉｆｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕｎａｎＮｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００５，Ｈｕｎａｎ，ＣＨｌＮＡ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ａ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆｎｏｎｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ ｅａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｆｔｅｅｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ＷａＳ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｐｐｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｄｏｅ ｌｉｎｅ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｎｏｎｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ ｂｙ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ＶｅｎＯｌｌＳ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗｉｈｔｏｕｔ Ｘ－ｒａｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ａ １０ ｐｏｌａｒ ｃａｐ ｏｆ ｓｉｎｕｓ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ５Ｆ ｒａｄｉａＩ ａｒｔｅｒｙ ｓｈｅａｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｖｅｎａ ｃａｖａ ｔｏ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ．Ｔｈｅｎ ｈｔｅ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ Ｗａｓ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐａｃｅ ｈｔｅｆｉｇｈｔｖｅｎｔｒｉｃｌｅｔｏ ｃｒｅａｔｅｔｈｅｔａｃｈｙｅａｒｄｉａ ｅａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙａｎｉｍａｌｍｏｄｅ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒｏｎｅｗｅｅｋｏｆｆｉｇｈｔｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒ ｐａｃｉｎｇ．ｃａｒｄｉａｃ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｅｎｌａｒｇｅｄｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｄｉｓａｔｏｌｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ｒｅｄｕｃｅｄｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ￣ｅｃｆｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＳｅｌＸｌｍ Ｂ－ｔｙｐｅ ｎａｌｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ０３ＮＰ）ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９（ＭＭＰ－９），ａｎｄ ｄｅ－ ｃｒｅａｓｅｄ ｉｔｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｏｔｒ ｏｆ ｍｅｔｌａｌｏｐｍｔｅｉｎａｓｅ－１ ｆｆＢ，ｗ一１１．ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｍｙｏｃａｒｉｄａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ 通讯作者：张翼。Ｅ—ｍａｉｌ：３４５６６５５６０＠ｑｑ．ｃｏｍ 离心１５ ｍｉｎ后效果较好，可以获取澄清的提取液。 【３】杨洪雁，杜智恒，白秀娟．水蛭药理作用的研究进展【Ｊ】．东北农业 并且提取液的ｐＨ值约为５．５，本身就有利于含量测定 大学学报，２０１２，４３（３）：１２８．１３３． 的顺利进行，所以滴定时不需再用ＮａＯＨ溶液调节其 ［４】来复根，金永昌．中药水蛭原动物的本草学考证［Ｊ】．现代应用药 学，１９８８，５（１）：１５． ｐＨ。水蛭中的水蛭素主要浓集在头部，身体部位的 ［５】ＥｌｅｃｔｒｉｃｗａｌａＡ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｏｍｂｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｆｒｏｍｔｈｅＬｅｅｃｈＨｉｍ— 水蛭素含量很少，本试验结果也反映了这一点；如果 ｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎａｉａ【Ｊ】．Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，１９９１，２ 在测定时滴加凝血酶过快则会导致结果偏低，且身体 （１）：８３—８９． 部位的提取液为深褐色导致刚刚出现白色絮状沉淀 ［６６］张彬，汪波，龚元，等．几种水蛭抗凝血物质提取及活性分 时很难发现。所以，延缓滴加凝血酶的间隔时间，采 析［Ｊ】．中山大学学报：自然科学版，２０１２，５１（４）：９２—９６． 用每隔２ ｍｉｎ滴加一次，并且适当降低凝血酶浓度， ［７】杨潼．中国动物志蛭纲［Ｍ】．北京：科学出版社，１９９６：１２０－１２２． ［８］丁家欣，张秋海，欧兴长，等．三种水蛭的薄层色谱与电泳法鉴别 这样可以使滴定终点准确快速的确认和测量结果更 【Ｊ】．中药材，１９９４，１７（１１）：２７９－２８１． 加准确可信。 ［９】范尚坦，李金兰，张勇，等．水蛭中水蛭素含量测定的改进【Ｊ】．中 参考文献 国中药杂志，２００８，３３（１９）：２２７７－２２７９． ・ ［１】周乐，赵文静，常惟智．水蛭的药理作用及临床应用研究进展 ［１０］卢舒凡，李庆国，许淑芹．广东菲牛蛭中有效抗凝物质的分离纯 ［Ｊ】．中医药信息，２０１２，２９（１）：１３２—１３３． 化【Ｊ】．医学研究杂志，２０１４，４３（５）：１０４—１０７． ｆ２】曾元儿．中国药典．一部［ｓ１．２０１０：７％７８． 日期：２０１５－０３－０７） ・２３４７・
