生物制品生物活性效价测定方法验证指导原则

⽣物制品⽣物活性/效价测定⽅法验证指导原则⼀、前⾔

对药品质量控制分析⽅法进⾏验证的⽬的是证明采⽤的⽅法适合于相应检测要求。⽣物制品质量控制中⽣物活性/效价为反映⽣物制品有效性的关键质量属性，对相应的测定⽅法进⾏规范的验证是保障其适⽤性的前提。本指导原则从验证⽅案的制定、各验证指标的具体验证策略、验证结果的记录和⽅法的监控及再验证的⾓度阐述了⽣物活性/效价测定⽅法验证相关的要求，旨在对新建的或拟修订的⽣物制品⽣物活性/效价测定⽅法所开展的验证⼯作进⾏规范与指导。本指导原则中的⽣物活性/效价测定主要是指相对效价测定，该法系将供试品的⽣物反应与已知标准品产⽣的反应相⽐较，从⽽定量测定供试品相对于标准品的效价。⼆、⽅法验证的基本要素1.验证⽅案

⽅法验证需根据验证⽅案来完成。验证⽅案不仅应包括验证设计、验证指标、合理的可接受标准和数据分析计划，还应涵盖不符合可接受标准时可采取的措施等。1.1验证设计

验证设计主要涉及样品的选择、实验变异来源的考量及试验重复策略等。应采⽤具有代表性的样品进⾏验证试验，并在验证⽅案中注明所需样品的类型及数量。实验变异的来源主要包括样品的制备、试验内和试验间的影响因素。试验内变异可能受⽅法开发阶段所确定的实验条件（温度、pH、孵育时间等）、实验设计（动物数量、稀释度组数、每个稀释组的重复数、稀释度间隔等）、试验过程、系统适⽤性和样品适⽤性要求、统计分析等因素的影响。⽽试验间变异主要受不同分析⼈员、不同试验时间、不同仪器设备和试剂批次等因素的影响。因此，⼀个设计良好的验证⽅案应综合考量试验内和试验间变异的来源。此外，每轮验证试验中标准品和供试品均应独⽴制备。验证中使⽤的重复策略应尽量反映影响效价测定结果的实验因素。1.2验证指标与可接受标准

由于相对效价测定⽅法各具特点，并随分析对象⽽变化，因此需视具体⽅法

拟订具体的验证指标，关于常见验证指标的具体讨论见本节“2.各验证指标的验证策略”项下。应根据测定⽅法特点和验证⽬的来确定各验证指标的可接受标准。在评估某些验证指标是否符合可接受标准时，除了判定验证结果是否符合预设标准外，还可通过等效性检验⽅法判定验证结果的置信区间是否也符合要求。同时还应分别建⽴试验有效性的可接受标准（系统适⽤性要求）和样品结果有效性的可接受标准（样品适⽤性要求），上述标准可根据⽅法开发的情况制定，但最终需根据验证的数据进⾏修正并在验证完成前确定。1.3数据分析计划

应按照验证⽅案中列出的数据分析计划对验证结果进⾏分析，包括对验证指标结果的绘图和统计学分析，以及判断它们是否符合可接受标准等。常规的统计学⽅法⼀般要求数据之间相互独⽴，并呈近似正态分布和⽅差齐性。⽽测得的相对效价在多数情况下服从近似对数正态分布，因此，为满⾜上述统计学要求，通常采⽤相对效价的对数转换值进⾏数据分析，本指导原则中对数转换的底数可取任⼀适⽤的底数，⼀般以⽆理数e或10为底。当⽆法满⾜上述统计学要求时，也可考虑采⽤其他适宜的替代⽅法进⾏数据分析。可在测定⽅法开发阶段通过对适量历史数据的分析⽽获知测得的相对效价的分布情况，若确定测得的相对效价为正态分布，则可直接采⽤测得值按下述统计⽅法进⾏数据处理，此时精密度⼀般⽤标准偏差（SD）或相对标准偏差（RSD，%）表⽰。2.各验证指标的验证策略

常见的验证指标包括专属性、相对准确度、精密度、线性和范围，后四个指标的验证通常可进⾏合并设计。2.1专属性2.1.1定义

专属性系指在其它成分，如杂质、降解产物、基质等存在时，采⽤的测定⽅法不受这些成分的⼲扰能正确测定待测物的能⼒。专属性亦可指测定⽅法区分相关物质的能⼒，因此，对待测物中任何已存在的或新引⼊的相关物质均应加以研究。如⽅法专属性不强，应采⽤多种不同原理的⽅法予以补充。2.1.2评价⽅法

在杂质、降解产物或基质可获得的情况下，往平⾏稀释的标准品溶液中加⼊

潜在的⼲扰物，并与未加⼲扰物的标准品溶液⽐较测得的相对效价的结果，采⽤合适的等效性检验⽅法考察⼆者剂量反应曲线的相似性和效价测得结果的⼀致性。也可取基质或与待测物结构相似的产品相关产物或⾮相关物质进⾏试验，基质、产品相关产物或⾮相关物质应均呈阴性反应。

在杂质、降解产物或基质不能获得的情况下，也可⽤强光照射、⾼温、⾼湿等⽅式对供试品进⾏加速破坏，以研究可能存在的降解产物和降解途径对相对效价测定的影响。2.2相对准确度2.2.1定义

系指在规定的范围内，测得的相对效价与真实值或参考值接近的程度，⼀般⽤相对偏差（RB，%）或其他适宜指标表⽰。2.2.2评价⽅法

在规定范围内，取标准品或已知效价的供试品稀释⾄不同的⽬标效价⽔平，⼀般⾄少需要评估3个效价⽔平，但为了获得更可靠的结果，推荐评估5个效价⽔平，每个效价⽔平分别⾄少独⽴测定3次。以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作直线回归。采⽤每个效价⽔平测定值的相对偏差和不同效价⽔平相对偏差的变化趋势或其他适宜指标来评价相对准确度，其中相对偏差的变化趋势可⽤直线回归⽅程的斜率进⾏评价。相对偏差计算公式如下：

在每个效价⽔平上，测得的相对效价的对数平均值的100（1-2α）%（通常取α=0.05，即90%）置信区间（CI），可按下式计算：式中，Average为每个效价⽔平效价测定值的对数平均值；SD为每个效价⽔平效价测定值的对数标准偏差；n为每个效价⽔平效价测定值的个数；t df为⾃由度为df时的t界值表查表值；

df为⾃由度，等于每个效价⽔平测定值个数减1。

再按下式计算每个效价⽔平上相对偏差的100（1-2α）%（通常取α=0.05，即90%）置信区间（CI RB）：式中，LCI为每个效价⽔平效价测定值的对数平均值的90%置信下限；UCI为每个效价⽔平效价测定值的对数平均值的90%置信上限。2.2.3数据要求

应报告每个效价⽔平效价测定值的相对偏差、直线回归⽅程的斜率或其他适宜的评价指标，上述指标均应符合验证⽅案中预先设定的可接受标准。必要时还应报告相对偏差或其他适宜指标的置信区间。2.3精密度2.3.1定义

精密度系指在规定的条件下，同⼀份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，包括重复性、中间精密度和重现性。由于相对效价测定⽅法的中间精密度包含重复性考察，因此，本指导原则中主要介绍中间精密度的评价⽅法，必要时还应进⾏不同实验室间的重现性考察。相对效价测定⽅法的精密度⼀般⽤⼏何标准偏差（GSD）或⼏何变异系数（GCV，%）表⽰，可采⽤下述⽅法或⽅差分析法（ANONA）进⾏评价。2.3.2评价⽅法

在规定范围内，考察随机变动因素如不同⽇期、不同分析⼈员、不同仪器、不同关键试剂批次等对精密度的影响，实验设计同2.2.2项。以每个效价⽔平测得的相对效价的⼏何标准偏差或⼏何变异系数来评价中间精密度。

在每个效价⽔平上，测得的相对效价的⼏何标准偏差计算公式如下：式中，SD为每个效价⽔平效价测定值的对数标准偏差。

在每个效价⽔平上，测得的相对效价的⼏何变异系数计算公式如下：

对于SD，仅需关注其100（1-α）%（通常取α=0.05，即95%）的置信上限（CI SD），其计算公式如下：式中，n为每个效价⽔平效价测定值的个数；为⾃由度为n-1时的 2界值表查表值。

因此，在每个效价⽔平上GSD的100（1-α）%（通常取α=0.05，即95%）的置信上限（CI GSD）计算公式为：在每个效价⽔平上GCV的100（1-α）%（通常取α=0.05，即95%）的置信上限（CI GCV）计算公式为：2.3.3数据要求

应报告每个效价⽔平效价测定值的⼏何标准偏差、⼏何变异系数或相应的置信区间，⼏何变异系数应符合验证⽅案中预先设定的可接受标准。采⽤⽅差分析法进⾏评价时，还可报告各效价⽔平合并计算后总的⼏何变异系数，并分析变异来源。2.4线性2.4.1定义

通常系指在设计的范围内，测得的相对效价与真实值或参考值之间的线性关系，为与相对准确度相关的稀释线性。2.4.2评价⽅法

在规定范围内，取标准品稀释⾄不同的⽬标效价⽔平，通常⾄少制备3个效价⽔平的标准品溶液，但推荐评估5个效价⽔平。以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作图，采⽤最⼩⼆乘法进⾏线性回归。2.4.3数据要求

应列出线性图、直线回归⽅程、斜率、y轴截距和相关系数。相关系数应符合验证⽅案中预先设定的可接受标准或直线回归⽅程的显著性检验应具有统计学意义。2.5范围2.5.1定义

系指测定⽅法能达到⼀定相对准确度、中间精密度和线性要求时的⾼低限相对效价⽔平或量的区间。2.5.2评价⽅法

该范围通常来源于稀释线性研究，评估的效价⽔平应⾄少涵盖产品效价质量

标准的范围。对于稳定性研究或其他特殊情况，可视具体情况适当扩⼤⽅法验证的范围。2.5.3数据要求

应报告相对准确度、中间精密度和线性符合要求时的相对效价⽔平或量的范围。2.6其他验证指标的考虑

由于通则9101介绍的其他验证指标如检测限和定量限与报告相对效价的⽣物检定⽅法⽆关，因此，上述指标在本指导原则均未涉及。此外，耐⽤性也未列⼊本指导原则的验证要求中，建议在测定⽅法开发阶段或预验证阶段进⾏该指标的考察，以确定测定⽅法的重要实验参数及相应的范围，并建⽴⼀系列的系统适⽤性要求。但对于⼀些关键因素如孵育时间、孵育温度、细胞代次和细胞数量等在验证时仍需进⼀步开展耐⽤性研究，尤其是当这些因素与验证中引⼊的其他因素有相互作⽤时。3.验证结果的记录

验证结果应记录在验证报告中。验证报告可包含原始数据和中间结果，⼀般应报告每个效价⽔平验证指标的测定值或各效价⽔平合并计算后的总体测定值。预验证的实验结果也可纳⼊验证报告中，这将有助于确定测定⽅法的最终实验条件。若验证结果均符合可接受标准，即可得出测定⽅法适⽤于其检测⽬的的结论；反之，当验证结果与验证⽅案规定的可接受标准有偏差时，应对验证失败的原因进⾏分析，并提出失败后的纠正措施，如优化⽅法的实验条件、修改⽅法的重复策略或视情况修正可接受标准等。4.⽅法的监控及再验证

相对效价测定⽅法经过验证后即可开始使⽤，但仍需对其性能进⾏持续的监控。最简单的监控⽅法即是对适宜的参数采⽤统计过程控制（SPC）图进⾏持续监控，如标准品的剂量反应曲线和质控品的效价测定值等。这些SPC图可⽤于识别相对效价测定⽅法早期的波动或漂移，若在SPC图中观察到任何变化趋势，即应对产⽣该趋势变化的原因进⾏调查。由于药品⽣产⼯艺变更、制剂的组分变更或其他原因需对测定⽅法进⾏较⼤改动时，应根据⽅法修订的程度确定再验证的范围。相对效价测定⽅法的再验证包括重新执⾏⼀次完整的验证或通过桥接实验来将原始测定⽅法过渡到修订⽅法。三、⽅法验证实例

本节分别列举了⼀个基于细胞的体外⽣物学活性测定法和基于动物的体内⽣物学活性测定法的验证实例，以阐述不同⽣物活性测定⽅法的验证过程。需要说明的是，本节实例仅作为演⽰分析步骤和计算过程⽤，不同的测定⽅法可根据其具体特点选择与实例中不同的实验设计和制订不同的可接受标准。68.5%66.7%.7%

63.9%71.3%65.3%65.3%66.4%80%86.4%93.6%76.5%80.4%82.0%85.4%75.2%87.5%85.3%83.1%81.5%79.7%87.0%80.0%83.2%87.8%100%117.4%109.2%94.9%95.1%105.3%107.9%105.5%91.3%101.7%1071.4%184.7%165.7%157.6%156.7%174.5%165.6%161.4%173.5%171.6%160.2%156.1%162.7%163.3%167.0%165.1%2．可接受标准及验证结果2.1相对准确度2.1.1可接受标准

每个效价⽔平相对效价测定值的相对偏差应在±12%范围内；以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作直线回归，回归⽅程的斜率应在0.80～1.25范围内。2.1.2验证结果

按“⼆、⽅法验证的基本要素”中2.2.2相对准确度评价⽅法项下计算公式

计算每个效价⽔平相对效价测定值的⼏何标准偏差、⼏何变异系数及其置信上限，结果见表3。每个效价⽔平相对效价测定值的⼏何变异系数均⼩于20%。表3GCSF不同效价⽔平相对效价测定值的⼏何标准偏差、⼏何变异系数及置信上限效价⽔平试验次数GSD CI GSD GCV CI GCV%8 1.047 1.086 4.7%8.6%80%8 1.046 1.084 4.6%8.4%100%8 1.065 1.121 6.5%12.1%125%8 1.061 1.113 6.1%11.3%156%8 1.052 1.095 5.2%9.5%

注：表中反对数转换的底数取e，计算95%置信上限时 20.95，7=2.17。2.3线性

2.3.1可接受标准

以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作图，采⽤最⼩⼆乘法进⾏线性回归。直线回归⽅程的相关系数应不低于0.98。2.3.2验证结果

以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作图，采⽤最⼩⼆乘法进⾏线性回归，结果如图1所⽰。拟合的直线回归⽅程为y=1.0182x+0.0385，相关系数为0.987。

图1GCSF效价理论值对数值与测定值对数值的直线回归⽅程2.4范围2.4.1可接受标准

报告相对准确度、中间精密度和线性符合要求时的效价⽔平范围，该范围应⾄少涵盖相对效价的质量标准范围（80%～150%）。2.4.2验证结果

本法中相对准确度、中间精密度和线性均符合要求的效价⽔平范围为%～156%，涵盖了其质量标准范围。（⼆）、体内⽣物学活性测定法1.实验设计及测定结果

以通则1216卵泡刺激素⽣物测定法的验证为例，考察测定⽅法的相对准确度、中间精密度、线性和范围，四项指标的验证采⽤合并设计。取尿促性素国家标准品，⽤制备的溶剂配成每1ml中分别含5.6单位的标准品溶液⾼剂量组及4.48、5.6和7IU的待测溶液⾼剂量组，然后采⽤⾼剂量组溶液依次制备中剂量

100%30.0466104.8% 4.8%125%30.1461115.7%-7.4%2.2中间精密度2.2.1可接受标准

每个效价⽔平相对效价测定值的⼏何变异系数(GCV，%)应不⼤于20%。2.2.2验证结果

按“⼆、⽅法验证的基本要素”中2.3.2中间精密度评价⽅法计算每个效价

⽔平相对效价测定值的⼏何标准偏差和⼏何变异系数，结果见表6。每个效价⽔平测定值的⼏何变异系数均⼩于20%。表6卵泡刺激素不同效价⽔平测定值的⼏何标准偏差和⼏何变异系数效价⽔平试验次数GSD GCV80%3 1.13413.4%100%3 1.053 5.3%125%3 1.062 6.2%2.3线性2.3.1可接受标准

以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作图，采⽤最⼩⼆乘法进⾏线性回归。采⽤F检验进⾏直线回归⽅程的显著性检验，应具有统计学意义。2.3.2验证结果

以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作图，采⽤最⼩⼆乘法进⾏线性回归，结果如图2所⽰。拟合的直线回归⽅程为y=1.1376x-0.0097，相关系数为0.84，采⽤F检验进⾏回归⽅程的显著性检验，直线呈显著回归（P=0.004）。

图2卵泡刺激素效价理论值对数值与测定值对数值的直线回归⽅程2.4范围2.4.1可接受标准

报告相对准确度、中间精密度和线性符合要求时的效价⽔平范围，该范围应⾄少涵盖相对效价的质量标准范围（80%～125%）。2.4.2验证结果

本法中相对准确度、中间精密度和线性均符合要求的效价⽔平范围为80%～125%，涵盖了其质量标准范围。四、统计学⽅法及术语

1.系统适⽤性（System Suitability）判断试验结果有效性的要求，考察试验体系是否能够按照试验⽅案的规定良好运⾏。2.样品适⽤性（Sample Suitability）判断样品结果有效性的要求，主要通过供试品和标准品剂量反应曲线的相似性来评价。

3.等效性检验（Equivalence Test）⼀种通过⽐较两个量值的差异是否符合给定的置信区间可接受标准来判断两个量值是否等效的统计学⽅法。常⽤的等效性检验⽅法有双单侧t检验法（Two One-SidedTest，TOST）。

4.对数正态分布（Log Normal Distribution）将随机变量取对数后呈正态分布。

5.相似性（Algebraic Similarity）在供试品和标准品具有同质性的前提下，供试品和标准品的剂量反应曲线在某种程度上呈代数相关，⼀般表现为剂量反应曲线平⾏。6.置信区间（Confidence Interval，CI）在给定的置信⽔平下，由统计学⽅法计算出的包含参数真值的随机区间。7.对数平均值（Log Mean Value）将随机变量取对数后求其平均值。

8.对数标准偏差（Log Standard Deviation）将随机变量取对数后求其标准差。

9.⽅差分析法（Analysis of Variance，ANOVA）通过分析研究不同来源的变异对总变异的贡献⼤⼩，从⽽确定各种因素对实验结果影响的⼤⼩。10.统计过程控制（Statistical Process Control，SPC）⽤于监控过程中的漂移或变化趋势的⼀套统计学⽅法。课题承担单位：上海市⾷品药品检验所021-********-26104协作单位：⼴东省药品检验所