维普资讯 http://www.cqvip.com ２００８年７月 广西轻工业 ＧＵＡＮＧＸＩ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＬＩＧＨＴ ＩＮＤＵＳＴＲＹ 食品与生物 第７期（总第１１６期） 粘红酵母胡萝卜素高产菌株的诱变选育 何海燕，覃拥灵 （河池学院化学与生命科学系／桂西北特色资源研究与开发广西高校重点建设实验室。广西宜州５４６３００） 【摘 要】以甘蔗糖蜜为碳源，摇瓶发酵初筛，从１０株酵母茵中筛选得到一株生物量和胡萝卜紊含量均较高的菌株Ｒ３。 利用紫外诱变，选育出一株正突变菌株Ｒ３—２５，在同等发酵条件下，生物量达到１１，３４ｍｇ／Ｌ，胡萝卜紊含量０，７６７ｍｇ／ｇ，胡萝卜素 产量为８．７０ｍｇ／Ｌ，比出发菌株提高了１、９０倍。该菌株连续１０次传代，其产量性状无大变化，遗传性状稳定。 【关键词】粘红酵母；胡萝卜素；甘蔗糖蜜；紫外诱变 【中图分类号】Ｑ９３９．９９ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】 １００３—２６７３（２００８）０７—０１—０２ 胡萝卜素作为优良的食品着色剂、营养增补剂、保健制 剂，广泛应用于医药、食品及饲料行业，市场上的需求量日益 增大【ｌ１。利用红酵母发酵生产胡萝卜素，具有营养要求简单、培 养周期短、菌体可综合利用、发酵过程易于产业化，具有很高的 应用价值和开发前景翻。甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的主要副产物， 种。用５ｍＬ无菌水洗下斜面菌种，倒入装液量２０ｍＬ／１００ｍＬ的 种子培养基中，２８℃，１ ８０ｒ／ｍｉｎ培养３６ｈ，扩大培养种子液。按 １ ｏ％接种量接人装液量２００ｍＬ／５００ｍＬ的液体发酵培养基中， ２８℃，１ ８０ｒ／ｍｉｎ培养４８ｈ。８０００ｆｆｍｉｎ离心１ ５ｍｉｎ，收集菌体测胡 萝卜素产量，选取胡萝卜素产量最高的菌株进行诱变改良育种。 １，２．２紫外诱变实验 总糖份在５０％左右，且含有维生素及微量元素等多种可利用 成分，是酵母发酵生产的良好原料嘲。中国的甘蔗种植业发展较 １．２．２．１初筛菌株生长曲线的测定 快，甘蔗糖蜜原料充足，价格低廉，是一种重要的经济资源Ｈ。 本研究选择甘蔗糖蜜作为碳源，以前期实验筛选得到的粘红 酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）作为出发菌株进行诱变选育实验， 初筛菌株经斜面培养后取一环至麦芽汁培养液中，摇床培 养从５ｈ后开始，每隔２ｈ取样测其ＯＤ值，以培养时间为横坐 标，ＯＤ值为纵坐标绘菌株生长曲线，根据生长曲线选择对数期 的细胞进行诱变实验。 １．２．２．２紫外诱变致死率曲线 以期得到能高效发酵生产胡萝卜素的优良菌种。 １材料与方法 １．１材料 将活化培养至对数期的培养液离心洗涤，加人生理盐水振 荡成菌悬液，用无菌脱脂棉过滤，参照文献嘲进行诱变处理，计 １．１．１菌种 粘红酵母（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）：本实验室保存共１０株，编号依次 为Ｒ１ Ｒ１０。 １．１．２仪器 算致死率，绘制致死曲线图。 １．２．２Ｉ３酵母菌株诱变突变株筛选 根据致死率曲线，以致死率达９０％以上的诱变剂量处理菌 悬液，辐射后涂布于筛选平板，２８℃培养３ｄ后从平板上挑选生 长较快、红色或橙红色的菌落进行摇瓶发酵复筛，８０００ｒ／ｍｉｎ 离心１５ｍｉｎ，收集菌体测其胡萝卜素产量。 １．２．２．４遗传稳定性实验 ＢＡＣＫＭＡＮＪ２—２１高速冷冻离心机Ｃ美国Ｂａｃｋｍａｎ公司）； ＹＰ１２００型电子天平（上海精科实业有限公司）；ＳＰＸ一２５０型 生化培养箱（上海跃进医疗仪器厂）；ＨＱＬ３００Ａ柜式恒温冷冻 摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；１０１—２一ＢＳ电热恒温鼓风 干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；糖用锤度计（浙江余桃仪表二 厂）；３２０ ｐＨ Ｍｅｔｅｒ（Ｍｅｔｔｌｅｒ ｔｏｌｅｄｏ公司）；ＵＶ一１６０１紫外分光 将筛选到的菌株接种于麦芽汁培养基上传代，共传１０代， 相同条件下发酵培养，测定生物量和胡萝卜素产量，检测诱变 得到的高产菌株的遗传稳定性。 １ ２．３生物量测定 光度讯日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ公司）。 １．１．３培养基 发酵液８０００￣ｍｉｎ离心１ ５ｍｉｎ，蒸馏水洗涤两次，收集菌 体，８０℃烘干至恒重，称量并记录数值。 １．２．４胡萝卜素的提取ｉ７１ 糖蜜使用前按文献四处理备用。 斜面活化培养基：１２。Ｂｘ麦芽汁，２％琼脂。 液体种子培养基：糖蜜１ ０ｏ Ｂｘ，硫酸铵０．５％，酵母膏 ０．１％，磷酸二氢钾０．１％，ｐＨ６．０。 准确称取菌体０．１ｇ，石英砂０．０５ｇ充分研磨，然后加入 ６ｍＬ丙酮：石油醚＝１：１（ｖ：ｖ）的混合液，２８℃振荡浸提 ３０ｍｉｎ，然后８０００ｄｍｉｎ离心１５ｒａｉｎ，收集上清液即得胡萝卜 素浸提液。 １．２．５胡萝卜紊的测定Ｍ 液体发酵培养基：同液体种子培养基。 平板筛选培养基：糖蜜１０。Ｂｘ，硫酸铵０．５％，酵母膏０．１％ ，磷酸二氢钾０．１％，自然ｐＨ，琼脂２％。 １Ｉ２方法 １．２．１菌种初筛 将浸提液适当稀释后用分光光度计在４７５ｎｍ下测定吸光 度值，按下式计算胡萝卜素含量： 胡萝卜素含量（ ｇ，ｇ菌体）＝Ａ ｍａｘ×Ｄ×Ｖ／０．１６×Ｗ 接一环保藏菌种至斜面活化培养基，２８℃培养３６ｈ复苏菌 【作者简介】￣ｆｆ￣．（１９７２一），女，讲师，硕士，从事应用微生物学研究。 １ 维普资讯 http://www.cqvip.com 式中：Ａ ｍａｘ一类胡萝ｂ素最大吸收波长下的吸光度； ｖ一提取所用溶剂量ｆｍＬ１； Ｄ一测定试样时的稀释倍数； ｗ一酵母菌体重量（ｇ）； Ｏ．１６一类胡萝ｂ素的克分子消光系数。 １．２．６胡萝卜素产量 胡萝卜素产量ｆｍｇ／Ｌ）：细胞生物量（ｇ／Ｌ）×胡萝ｂ素含量 ｆｌｎｇ／ｇ） ２结果及分析 ２．１初筛 通过初筛从１ Ｏ株出发菌株中获得一株生物量和胡萝卜素 含量均较高的酵母菌株Ｒ３，结果见表１。 表１菌株的生物量和胡萝卜紊产量比较 从表１得知，不同菌株的生物量及胡萝ｂ素含量均不相 同，有的菌株生物量高而胡萝ｂ素含量不大；有的菌株生物量 低却具有较高的胡萝ｂ素含量，综合考虑相同体积发酵液所收 获的细胞生物量和胡萝ｂ素含量即胡萝ｂ素产量的大小， 选择 胡萝ｂ素产量最高的粘红酵母菌株Ｒ３作为诱变的出发菌株。 ２．２初筛菌株生长曲线的测定 诱变处理的菌株一般要求处于对数生长期，此时群体生长 状况比较同步，代谢活性酶活性高而稳定，生活力强，易变异， 重复性较好，所以选用对数期的细胞进行处理。由图１可知，对 数生长曲线为８—１８ｈ，２０ｈ后进入稳定期，因此选择已培养了 １４ｈ的菌液进行诱变处理。 ０．９ ０・８ ０・７ ＾０．６ 曼ｏ．５ ０．４ ０．３ ０・２ ０・１ ０ ０ ５ ｌＵ ｌ５ ２Ｏ ２５ 时间（ｈ） 图１菌株Ｋ３的生长曲线 ２．３紫外诱变的致死率曲线 随着紫外辐射时间的增大，平板上的菌落数逐渐减少，即 致死率逐渐增大。当照射时间为１２５ｓ时，致死率达９４％，结果 见图２。根据致死率越高突变机率越高的诱变机理，选用致死 ２ 率为９４％的１ ２５ｓ照射时间做下一步诱变实验。 图２紫外线照射致死率曲线 ２．４紫外诱变突变株筛选 通过对紫外诱变突变株的筛选，得到ｌ Ｏ株胡萝ｂ素产量 较高的正突变株，其生物量、胡萝ｂ素含量和胡萝ｂ素产量对 比如表２： 表２紫外诱变菌株生物量和胡萝卜紊含量的比较 通过对比实验，与菌株Ｒ３相比，突变菌株Ｒ３—２５的生物 量是原来的１．２８倍，胡萝ｂ素含量是原来的１．４９倍，胡萝ｂ素 产量是原来的１．９Ｏ倍，产量有了较大提高，结果如表３所示。 表３菌株Ｒ３与Ｒ３—２５的生物量和胡萝卜素含量的对比 ２．５遗传稳定实验 菌株Ｒ３—２５传代１Ｏ次，其生物量、胡萝ｂ素含量、胡萝 ｂ素产量基本稳定。这表明突变菌株Ｒ３—２５有良好的遗传稳 定性，如表４所示。 ３结论 本实验以甘蔗糖蜜为唯一碳源，通过初筛和紫外诱变筛选 得到正突变粘红酵母菌株Ｒ３—２５，其胡萝ｂ素产量为 ８．７０ｍｇ／Ｌ，是诱变前菌株Ｒ３的１．９Ｏ倍。Ｒ３—２５菌株传代１Ｏ 次，其生物量、胡萝ｂ素含量、胡萝ｂ素产量基本稳定，具有良 好的遗传稳定性。实验表明粘红酵母菌株Ｒ３—２５可以较好的 吸收利用甘蔗糖蜜；粘红酵母菌株对紫外线敏感，可利用紫外 诱变进行菌种选育，提高其胡萝ｂ素产量。 （下转第２３页） 维普资讯 http://www.cqvip.com
表２各影响因子对苄又含量、邻氯甲苯转化卒和邻氯氯苄收率 的位级和 表３优住级实验条件复证实验结果 塑 茎 ｉ堕…… ．．．一 时间 ２ ２＂０ ４ Ｉ５ Ｋ３ Ｒｊ ３ ３７ ｔ ９５ 墼至 温度 ３ ８８ ２ ３Ｔ ３ ４７ １＿５Ｉ 塑 从优位级实验可知；在选定的条件下，邻氯甲苯的转化率 可达７８．３％，同时邻氯氯苄的收率也在９０％以上。 由表１与表２的实验数据可知： （１）通氯时间、反应温度和光源对反应液中苄叉含量和邻 氯氯苄收率的影响不大。 （２）反应温度对邻氯甲苯转化率的影响最大，是影响反应 慧 的主要因素。反应温度为１４０￣Ｃ时，转化率最大为７７．７％；反应 温度为１ １０℃时，转化率最小为３８．４％；反应温度为１２５℃时，转 化率为６５．４％。因此优位级反应温度取１ ４０￣Ｃ。 ４结论 用日光作光源，在１４０￣Ｃ左右通氯反应１６小时，邻氯甲苯 光氯化的转化率可达７８％，邻氯氯苄的收率达９０％以上，从而 在很大程度上降低了产品的生产成本，其生产工艺技术水平已 大大超过了目前国内同行业先进水平，经济效益和社会效益 显著，因此具有很好的工业化应用前景。 参考文献 ［１］崔永信．邻、对氯氯苄生产工艺的改进Ⅱ］．中国氯碱，２００４，（７）：２４—２６． ［２］邻、对氯甲苯下游产品情报调研报告田．湖南化工信息中心，１９９３，（９）． ［３］唐薰，刘鑫．邻氯氯苄的合成及其下游产品卧氯碱工业，１９９８，（６）： ２０－２２． ｍ （３）通氯时间对邻氯甲苯转化率的影响较大，是影响反应 的另一主要因素。通氯时间为１２小时，转化率为４２％；通氯时 间为１６小时，转化率最大为７３％；通氯时间为２０小时，转化率 为６１％。因此优位级通氯时间取１６小时。 （４）光源对邻氯甲苯转化率的影响最小。反应用日光时， 叭 转化率为６６％；反应用紫光时，转化率为６１％；反应用兰光时， 转化率为５３％。由于日光灯最常用，因此优位级光源取日光灯 灯光。 可见，合成邻氯氯苄的优化条件应为在日光灯照射下于 １４０￣Ｃ通氯反应１６小时。 ３．２优位级实验条件复证实验 ［４］徐正安，李红，李玉林，黄斌．对氯氯苄的合成卧江西化工，１９９９，（３）： １８—２０． 对上述正交实验得到的优位级实验条件进行复证，具体实 验结果见表３。 ［５］王智巧．氯化苄生产工艺技术改进Ⅱ］．河北化工，２００３，（４）：２４—２６． （上接第２页） 表４ Ｒ３—２５的传代实验结果 条件的进一步优化，菌种的复合诱变改良以适应高糖浓度的生 产以及胡萝卜素的分离提取、富集方法上。 参考文献 ［１］张博润，寇运同，刘玉芳．胡萝卜素产生茵粘红酵母ＺＲ－５的培养优 化务件研究Ｕ］．微生物学通报，１９９５，２２（４）：２１２—２１４． ［２］王岁楼彳日用红酵母发酵生产ｐ ２胡萝卜素的研究进展啊．微生物学 杂志，２０００，２０（２）：４１—４３． ［３］王兰，肖冬光 以甘蔗糖蜜为碳源发酵生产海藻糖的研究田．生物技 术，２００３，１３￣）：３０－３２． ［４］何海燕，覃拥灵等．甘蔗糖蜜发酵培养高铁营养酵母的菌种诱变选育 Ⅱ］＇食品研究与开发，２００７，４（１３７）：５０—５３． ｆ５］张克旭．氨基酸发酵工艺学ｆＭ］．北京：中国轻工业出版社，１９９２． ［６］陈代杰，朱宝泉．工业微生物茵种选育与发酵控制技术口 ．北京：化工 出版社．１９９０． 胡萝卜素作为一种优良的食品着色剂、营养增补剂、保健 ［７］翟红梅，肖冬光，张坤生．粘红酵母发酵生产类胡萝卜素培养条件的优 化卧生物技术，２００３，１３（５）：３０－３５． 制剂，市场需求量很大。以价格低廉的甘蔗糖蜜为唯一碳源，利 用粘红酵母菌株Ｒ３—２５发酵生产胡萝卜素，极大的提高甘蔗 糖厂制糖副产物的附加值，变废为宝，具有良好的社会效益和 经济效益。 ［８］ｇａ￣，吉春明．一种简单的胞壁破碎方法卟微生物学通报，１９９５，２２ （１）：５８－５９ 今后研究重点应该放在甘蔗糖蜜发酵生产胡萝卜素培养
