！ 生 旦筮 鲞筮 Ｑ翅 旦』 ｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｙ １５，２０１２。Ｖｏ１．６。Ｎｏ．１０ ・论著・ 肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子在 骨关节炎软骨细胞的表达及诱导 产生ＭＭＰ一９的研究意义 陈雾 陈Ｉ阮王梓张国元唐中 赵明才 【摘要】 目的方法通过观察肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（ＴＷＥＡＫ）在骨关节炎（ＯＡ）软骨细胞的表 达情况，研究ＴＷＥＡＫ诱导软骨细胞产生基质金属蛋白酶（ＭＭＰ－９）的影响，探讨其在ＯＡ发病中的作用机制。 体外分离培养ＯＡ软骨细胞，用ＲＴ—ＰＣＲ和免疫荧光法检测ＭＭＰ－９的表达；将软骨细胞与不同浓度水 平的重组人ＴＷＥＡＫ（ｒｈＴＷＥＡＫ）共培育，用ＥＬＩＳＡ法检测培养细胞上清液ＭＭＰ－９的水平。结果 ＲＴ．ＰＣＲ 及免疫荧光结果显示ＴＷＥＡＫ在ＯＡ软骨细胞的表达主要定位于细胞质中；当ＴＷＥＡＫ终浓度为２００ ｓ／Ｌ、 ５００ ｇ／Ｌ时，其诱导软骨细胞产生ＭＭＰ－９的水平明显高于对照组，具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。 结论ＴＷＥＡＫ在ＯＡ软骨细胞中广泛表达，其通过诱导产生ＭＭＰ－９引起ＯＡ软骨的破坏，从而在ＯＡ的发病 中起作用。 【关键词】 骨关节炎； 软骨细胞； 基质金属蛋白酶９； 肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＷＥＡＫ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｏｆ ＭＭＰ－９ ＣＨＥＮ Ｐａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｙｕｅ，ＷＡＮＧ Ｚｉ，ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ－ｙｕａｎ，ＴＡＮＧ Ｚｈｏｎｇ，ＺＨＡＯ Ｍｉｎｇ—ｃａｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＲｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｍｉｎｄｏｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＦ￣ｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅ￣ｉｔｙ，Ｎｉｎｇｄｅ ３５５０００，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡ０ Ｍｉｎｇ—ｃａｉ，Ｅｍａｉｌ：ａｒｏｇｅ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＷＥＡＫ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＴＷＥＡＫ ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｉｎ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｏｗ ＴＷＭｅｔｈｏｄｓ Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｃｅｌｌ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＷＥＡＫ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ． ＥＡＫ ｉｎ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ， ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＷＥＡＫ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｌｕｉｄ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｗａｓ ｍｅａｓｕｕｒｅｄ ｂｙ ＲＴ－ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＴＷＥＡＫ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｌｙ ｎｄ ｍａｉａｎｌｙ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＷＴＥＡＫ ａｔ ２００ ｇ／Ｌ ａｎｄ ５００ ｇ／Ｌ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＴＷＥＡＫ ａｔ １００ ｓ／Ｌ ｗａｓ １．２８ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（尸＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＴＷＥＡＫ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍａｉｎｌｙ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ＴＷＥＡＫ Ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ＭＭＰ－９ ａｎｄ ｄａｍａｇｅ ｔｈｅ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｎｄ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｙ ｏｆ ＯＡ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ； Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ； Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＴＮＦ—ｌｉｋｅ ｗｅａｋ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ印・ ｏｐｔｏｓｉｓ 骨关节炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＯＡ）是一种最常见的关节 不明确，但目前已清楚的是，ＯＡ关节软骨的降解是通 过多种细胞因子介导的，如多种基质金属蛋白酶 （ＭＭＰｓ）以及其他一些细胞激活后的产物…。肿瘤坏 死因子样弱凋亡诱导因子（ＴＮＦ—ｌｉｋｅ ｗｅａｋ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ａｐ— ｏｐｔｏｓｉｓ，ＴＷＥＡＫ）是肿瘤坏死因子配体超家族的新成 员，按被发现的时间先后也称为第十二成员（ＴＮＦ—ＳＵ— ｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １２，ＴＮＦＳＦ１２），现发现其具有广泛的 生物学活性，在多个系统的疾病发病机制中起着重要 疾病和分布最广泛的慢性疾病之一，而关节软骨的破 坏是ＯＡ的标志性特征。虽然确切的发病机制目前尚 ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１２．１０．０１５ 基金项目：国家自然科学基金（３０９７２７４９）；四川省科技厅应用基础 项目（２００８ＪＹ００１３） 作者单位：３５５０００福建省，宁德市闽东医院风湿科（陈雾）；川北 医学院附属医院检验科（陈悦、王梓、张国元、唐中、赵明才） 通讯作者：赵明才，Ｅｍａｉｌ：ａｒｏｇｅ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｌｌ ２０１２年５月第６卷第１０期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。Ｍａｖ １５，２０１２，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．１０ 作用［２］。已有研究发现，ＴＷＥＡＫ能促进炎症细胞因子 的释放，诱导ＭＭＰｓ的产生，能诱导多种细胞分泌促炎 症细胞因子和趋化因子及高表达ＭＭＰｓ和ＲＡＮＴＥＳ，从 而在ＯＡ的发病机制中起重要作用 ３ Ｊ。本研究旨在通 过对ＯＡ软骨细胞的体外培养及其相关研究，探讨 ＴＷＥＡＫ参与ＯＡ关节软骨破坏的可能机制，进而寻求 治疗ＯＡ的新方法。 材料与方法 一、实验材料 共３Ｏ例软骨组织标本均取材于川北医学院附属 医院骨科行髋关节或膝关节置换术的患者，所有患者 均有临床特征和影像学改变，且均符合１９９５年美国风 湿病学会（ＡＣＲ）修订的ＯＡ的分类标准。该研究得到 当地伦理委员会支持，且所有患者均签订知情同意书。 Ⅱ型胶原酶、胎牛血清购自Ｓｉｇｍａ公司。高糖ＤＭＥＭ 培养基、Ｔｒｉｚｏｌ购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。重组人ＴＷＥＡＫ （ｒｈＴＷＥＡＫ）购自ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ公司。兔抗人ＴＷＥＡＫ 多克隆抗体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ公司。ＦＩＴＣ 羊抗兔ＩｇＧ购自北京中杉金桥生物科技有限公司。 ＤＥＰＣ试剂购自Ｇｉｂｃｏ公司。ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒购自成都 博瑞克生物技术有限公司。ＭＭＰ－９ ＥＬＩＳＡ试剂盒购自 上海西唐生物科技有限公司。羊血清为四川省风湿免 疫研究所制备。 二、实验方法 １．ＯＡ软骨细胞的分离、培养：无菌获取经关节置 换术切除的关节软骨组织，选取肉眼观察大致正常的 关节软骨面，削取软骨层，用含青链双抗（１００ Ｕ／ｍ１）的 无菌ＰＢＳ液洗三遍，反复剪切成约１ ｍｍ。的组织块，再 用ＰＢＳ液洗三遍，置培养瓶中备用。采用胰蛋白酶一Ⅱ 型胶原酶顺序消化法消化分离软骨细胞 ｊ，先在剪切 好的软骨组织细块中加入６～８倍体积的０．２５％胰蛋 白酶３７℃消化１ ｈ，洗去胰蛋白酶，加入３—５倍体积 含ＤＭＥＭ的０．２％ＩＩ型胶原酶，３７ ｑＣ消化过夜，用２００ 目纱网过滤去除软骨残渣，８００～１０００ ｒ／ｍｉｎ低速离心 ５ ｍｉｎ收集细胞，ＰＢＳ液轻轻吹打洗涤两遍，加入含 １０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养液，分装于培养瓶中， 置３７ ｏＣ、５％ＣＯ 的湿孵箱中培养４８ ｈ，待大部分细胞 贴壁后，更换培养液，１０ ｄ左右细胞将长满瓶底呈单层 细胞，此即原代软骨细胞，按１：２比例传代培养，第３— ５代软骨细胞用于后续实验。 ２．软骨细胞总ＲＮＡ的提取：取对数生长期的软骨 细胞，经０．２５％的胰蛋白酶消化后，用ＰＢＳ悬浮并洗涤 细胞２遍，细胞计数后按１ ｍｌ／１０ 的量加入Ｔｒｉｚｏｌ，充 分吹打后转入ＥＰ管中，室温静置３ ｍｉｎ，加入氯仿（按 每ｍｌ细胞悬液加１００ ｌ Ｔｒｉｚｏ１），振荡混匀后静置 ５ ｒａｉｎ，４ ｏＣ、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取上清移人新的 ＥＰ管中（勿吸人沉淀），加入等体积的异丙醇，混匀 一２０℃孵育３０ ｍｉｎ，４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，去 上清，加入预冷的７５％乙醇１ ｍｌ，振荡１０ Ｓ，４ ｏＣ、 ７５００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，去上清用滤纸吸干并室温干燥 ３ ｒａｉｎ（勿让ＲＮＡ沉淀完全干燥），加入适量ＤＥＰＣ处理 水溶解，部分用于电泳、核酸紫外分光光度仪测ＲＮＡ 的纯度与浓度，其余一８０℃冻存。 ３．逆转录．聚合酶链反应（ＲＴ．ＰＣＲ）：ｃＤＮＡ合成采 用逆转录试剂盒，总体系为２０ ｗｌ：ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ Ｏ ９ ｗｌ、５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４ 、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）２ ｌ、 Ｓｕｐｅｒ—Ｒ１ ０．５ １、ＲＴ－Ｅｎｈａｎｃｅｒ ０．５ ｌ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ （２５ ｐｍｏｌ／￣１）１ ｌ、软骨细胞ＲＮＡ模板２ ｗｌ（＜１ ｇ）、 Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ １ ，混匀后瞬时离心３０ Ｓ，金属恒温加 热器中４２ ｃＣ、４０ ｍｉｎ一个温度完成反应，反应结束后 每份标本取２ ｌ用于ＰＣＲ扩增，其余冻存于一２０ ｃ【＝备 用。ＰＣＲ扩增ＴＷＥＡＫ全长编码序列引物：上游５ 一ＡＴ— ＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＣＧＧＡＧＣ－３ ，下游５ 一ＴＣＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧ— ＧＡＡＧＡＧＴＣ．３ ，扩增产物大小７７０ ｂｐ；内参ＧＡＰＤＨ引 物：上游５ ．ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ．３ ，下游５ 一 ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴ 【ＴＩ＇ＧＣＴＧＴＡ－３ ，扩增产物大小４５０ ｂｐ。 ＰＣＲ反应总体积为２０ ｌ，其中逆转录反应后原液２ 、 ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ ６ ｗｌ、上游引物（１０ ｐｍｏｌ／１．ｄ）１ ｌ、下游 引物（１０ ｐｍｏｌ／Ｉｘ１）１ ｌ、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０ ， 混匀后瞬时离心３０ ｓ，根据引物报告单的理论Ｔｍ值， ＰＣＲ仪上设条件参数：９５℃预变性２ ｍｉｎ，９５ ｏＣ变性 ３０ ｓ、６０℃退火３０ ｓ、７２℃延伸２ ｍｉｎ共３５个循环，最 后７２℃延伸５ ｍｉｎ，反应结束后取１０ １产物电泳，在 成像仪上成像保存。 ４．免疫荧光法检测ＴＷＥＡＫ在软骨细胞的表达： 将制备好的软骨细胞６孔板爬片，用ＴＰＢＳ洗涤３次， 每次１５ ｍｉｎ；用０．２％的皂素室温作用３０ ｍｉｎ，然后 ＴＰＢＳ洗涤３次每次１５ ｍｉｎ；用３％的过氧化氢室温作 用１５ ｍｉｎ，ＴＰＢＳ洗涤３次每次１５ ｍｉｎ；用二抗来源的动 物（羊）血清或３％ＢＳＡ室温封闭３０ ｒａｉｎ，ＴＰＢＳ洗涤３ 次每次１５ ｍｉｎ；吸取适量的ＴＷＥＡＫ一抗，用封闭液稀 释成１：１００的工作液，将６孔板分为上下两排，分设阴 阳性对照，每张盖玻片分别加一抗工作液和封闭液 １００ ，置于湿饭盒中，４℃孵育过夜；隔日取出６孔板 室温平衡１５ ｍｉｎ，ＴＰＢＳ洗涤３次每次１５ ｍｉｎ；避光吸取 适量的ＦＩＴＣ标记的羊抗兔二抗，用０．０１％的伊文氏蓝 稀释成１：１００的工作浓度，每张爬片加１００ ｗｌ，放湿饭 盒中，置于３７℃恒温箱中孵育４５ ｍｉｎ；避光，ＴＰＢＳ洗涤 三次每次１５ ｍｉｎ，用滤纸吸干液体，在载玻片上滴加抗 ２０１ 生 篡 鲞第１０期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｙ１５．２０１２．Ｖｏ１．６．Ｎｏ．１０ 荧光淬灭封片液，将盖玻片倒扣于载玻片上；荧光显微 镜下调整激发光至ＦＩＴＣ，观察软骨细胞ＴＷＥＡＫ的表 表１培养上清液ＭＭＰ－９的水平（ Ｌ，面±ｓ） 达并摄像保存。 ５．细胞因子刺激实验：将软骨细胞传代至３—５代 后，取处于对数生长期的细胞，经０．２５％的胰蛋白酶消 化后，反复轻轻吹打成单细胞悬液，倒置显微镜下计数 细胞，调整细胞密度为３×１０ ／Ｌ，每孔１ ｍｌ接种于６孔 细胞培养板，３７℃贴壁培养２４ ｈ后，去除培养液，用无 血清的ＤＭＥＭ‘培养液同步化培养２４ ｈ后，分别加入 ＴＷＥＡＫ（０、１０、５０、２００、５００ ｇ／Ｌ）各一孔，以０ ｇ／Ｌ为 注：与空白对照组比较， Ｐ＜Ｏ．ｏ５ 讨 论 空白对照组，置３７℃含５％ＣＯ 的湿孵箱内持续培养 ７２ ｈ后，收集细胞培养液和细胞。 ６．ＥＬＩＳＡ法检测细胞培养上清液ＭＭＰ－９的水平： 采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测细胞培养液中ＭＭＰ－９ 的浓度，按试剂盒提供的说明操作。试剂盒可检测重 组或天然的人ＭＭＰ－９，所有ＯＤ值都应减除空白值后 再行计算，以所测标准品ＯＤ值为纵坐标，标准品浓度 为横坐标，画出标准曲线。根据细胞培养液样品的ＯＤ 值在标准曲线图上查出相应ＭＭＰ－９的含量，再乘以稀 释倍数即可。 ７．统计学分析：检测的数据输人ＳＰＳＳ １３．０分析 软件，计量资料用均数±标准差（ ±ｓ）表示，两两比较 采用ｔ检验，多样本均数比较采用单因素方差分析 （Ｏｎｅ．Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ），Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。 结 果 １．软骨细胞的培养观察：原代软骨细胞接种培养 瓶后一般２４—７２ ｈ贴壁，通常１０—１４ ｄ长满瓶底。光 镜下单层原代软骨细胞呈角型、椭圆形或梭型外观，大 部分原代培养的软骨细胞均可形成局部的复层团块样 生长区——软骨细胞团（图１）；传代培养的软骨细胞 呈梭型或多角形，约７ ｄ左右生长成单层细胞。 ２．ＲＴ．ＰＣＲ结果：ＴＷＥＡＫ基因的ＰＣＲ扩增产物经 ｌ％琼脂糖凝胶电泳显示，在７７０ ｂｐ位置左右可见清晰 的单一条带（图２Ａ，２Ｂ），表明体外分离培养的ＯＡ软 骨细胞有ＴＷＥＡＫ ｍＲＭＡ的表达。 ３．ＴＷＥＡＫ在ＯＡ软骨细胞的表达情况：采用免疫 荧光法测定软骨细胞ＴＷＥＡＫ的表达，与阴性对照比 较，发现软骨细胞广泛表达ＴＷＥＡＫ分子，主要在细胞 质中，细胞膜也有少量表达（图３Ａ，３Ｂ）。 ４．ＴＷＥＡＫ对软骨细胞诱导产生ＭＭＰ－９的影响： ＷＴＥＡＫ诱导软骨细胞合成ＭＭＰ－９的水平显著高于对 照组，且呈明显的剂量依赖性，与空白对照组相比较具 有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＴＷＥＡＫ诱导合成ＭＭＰ－９ 的水平经ＥＬＩＳＡ检测结果如表１所示。 ＯＡ是一种常见的关节疾患，老年人群多发。ＯＡ 患者通常有关节的疼痛和关节功能的障碍，甚至关节 的强直，是影响老年人生活质量的主要疾病之一。我 国的流行病学调查显示，ＯＡ在６Ｏ岁以上人群中的患 病率高达４９％，随着我国人口逐步老龄化，ＯＡ患者数 将越来越多，ＯＡ已成为备受关注的医疗和社会问题。 目前普遍认为，多种ＭＭＰｓ对关节软骨细胞外基 质有降解作用，使关节软骨肿胀，抗外力作用下降，最 终导致关节软骨进行性破坏，从而在软骨的降解过程 中起着极为重要的作用。而一些细胞因子在 ＭＭＰｓ、ＲＡＮＴＥＳ的合成与分泌，进而在软骨降解中的作 用也越来越受到人们的关注，以期望能找到更好的治 疗方法。 研究发现，ＴＷＥＡＫ作为肿瘤坏死因子配体超家族 的新成员，可表达在多种细胞表面，具有诱导凋亡、血 管生成、促炎症反应、细胞增殖等一系列生物学活 性 Ｊ。ＴＷＥＡＫ的组织及细胞表达分布较广泛，在心 脏、肺、脾脏、胰腺、淋巴结、卵巢、骨骼肌等组织器官和 外周血淋巴细胞、血管平滑肌细胞等表达量都较高 Ｊ。 ２００８年日本Ｋａｍｉｊｏ等 通过流式细胞术（ＦＡＣＳ）证实 了ＴＷＥＡＫ和Ｆｎｌ４在新鲜分离的类风湿性关节炎 （ＲＡ）和ＯＡ滑膜细胞（ＳＣｓ）的表达。本研究通过ＲＴ． ＰＣＲ证实了ＴＷＥＡＫ在ＯＡ软骨细胞的表达，免疫荧光 法显示ＴＷＥＡＫ在ＯＡ软骨细胞广泛表达，且主要定位 于细胞质，细胞膜也有少量的表达，这和ＴＷＥＡＫ的跨 膜蛋白性质相一致。ＴＷＥＡＫ诱导ＭＭＰｓ的合成已得 到广泛的证实，如ＲＡ和ＯＡ成纤维样滑膜细胞、动脉 粥样硬化斑块的巨噬细胞、肌萎缩的骨骼肌细胞等。 国内夏丽萍等 ８ 研究了旨在通过观察ＴＷＥＡＫ在不同 浓度下对ＲＡ成纤维样滑膜细胞诱导合成ＭＭＰ－３的影 响，结果表明，ＴＷＥＡＫ通过诱导成纤维样滑膜细胞合 成ＭＭＰ．３，直接参与ＲＡ的关节损伤，ＴＮＦ一仅、ＩＬ－１１３在 其中起协同作用。国内管剑龙等Ｌ９ 通过对ＯＡ软骨细 胞和滑膜细胞的研究显示，白细胞介素（ＩＬ）－１１３、ＴＮＦ一 和双氯芬酸钠均能显著增强ＭＭＰ－９的活性，其中以ＩＬ— ２０１２年５月第６卷第１０期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｉｔｏｎ），Ｍａｙ１５，２０１２，Ｖｏ１．６ Ｎｏ．１０ １Ｂ作用最强，与ＴＮＦ— 或双氯芬酸钠有协同作用，提 志，２０００，４：５４３６． 示ＴＮＦ． 和ＩＬ一１ Ｂ可能为破坏关节软骨的重要细胞因 ［２］ 陈雾，张国元，赵明才．ＴＷＥＡＫ在自身免疫性疾病中的研究进展． 子。窦维新等－１ ０＿研究发现，ＩＬ一１和ＴＮＦ一仅与ＯＡ患者 国际免疫学杂志，２０１０，３３：９２－９６． ［３］ 陈悦，赵明才．肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂在骨关节炎中的 免疫炎症有关，其水平高低可反映病情活动变化情况， 作用［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电子版，２０１１，５：５３９２－５３９６． 与病变程度密切相关，联合检测这两种指标有助于病 ［４］ 刘军，戴刚，杨柳．骨关节炎软骨细胞的体外分离培养．中国组织 情判断。Ｄｈａｒｍａｐａｔｎｉ等 研究发现，ＴＷＥＡＫ／Ｆｎ－１４ 工程与临床康复，２００８，１２：９０４５－９０４８． 配受体在ＲＡ炎症及骨质破坏的发病机制中起重要作 ［５］ Ｗｉｎｋｌｅｓ ＪＡ．Ｔｈｅ ＴＷＥＡＫ—Ｆｎ１４ ｃｙｔｏｋｉｎｅ．ｒｅｅｅｐｔｅｒ ａｘｉｓ：ｄｉｓｃｏｒｅｒ，ｂｉｏｌｏ— 用。本研究发现外源性的ＴＷＥＡＫ能诱导体外培养的 ｇＹ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２００８，７：４ｌ１．４２５． ＯＡ软骨细胞合成ＭＭＰ－９，且呈明显的剂量依赖性，因 ［６］ Ｓａｎｚ ＡＢ，Ｓ６ｎｃｈｅｚ—Ｎｉｎｏ ＭＤ，Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ ＭＣ，ｅｔ ａ１．ＴＷＥＡＫ，ｔｌｌｅ ｆａｃｉｌｉ— ｔａｔｏｒ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ．Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ，２ｏｏ８．，２８：５８７－５９２． 而我们推测，ＴＷＥＡＫ可能通过诱导软骨细胞合成 ［７］ Ｋａｍｉｊｏ Ｓ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ａ，Ｋａｍａｔａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆＴＷＥＡＫ／ＦｎＩ４ ＭＭＰ．９而直接参与了ＯＡ软骨基质的破坏；但对于其 ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｆ ０ｘ— 机制有待于进一步深入研究，可能和ＴＷＥＡＫ与Ｆｎｌ４ ｆｏｒｄ），２００８，４７：４４２＿４５Ｏ． 受体结合，启动一些信号通路而影响ＭＭＰ一９的表达有 ［８］ 夏丽萍，肖卫国，李俊松，等．ＴＷＥＡＫ诱导类风湿关节炎成纤维样 关，具体激活了哪些信号分子还有待于今后的进一步 滑膜细胞合成ＭＭＰ－３的实验研究．细胞与分子免疫学杂志， ２０ｏ９．２５：４６４８． 研究。另外，ＴＷＥＡＫ在作用过程中的上游机制也有待 ［９］ 管剑龙，施桂英，韩星海，等．骨关节炎软骨细胞和滑膜细胞金属 于研究发现。同时，促炎症因子如ＴＮＦ－Ｏｔ、ＩＬ一１Ｂ是否 蛋白酶活性的影响因素．中华风湿病学杂志，２００１，５：１９－２２． 在其中起作用及机制还有待于进一步的研究。 ［１０］ 窦维新，焦绪民．骨性关节炎患者血清及膝关节液白细胞介素一１、 已有的研究表明，ＴＷＥＡＫ在包括自身免疫性、炎 肿瘤坏死因子一ａ的水平变化及意义．中国基层医药杂志，２０１０， １７：２１６９－２１７１． 症性以及退变性疾病等多个系统的疾病发病机制中起 Ｄｈａｒｍａｐａｔｎｉ ＡＡ，Ｓｍｉｔｈ ＭＤ，Ｃｒｏｔｔｉ ＴＮ．ＴＷＥＡＫ ａｎｄ Ｆｎｌ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 着重要作用，而抑制其作用将可能作为治疗的靶点 。 ｉｎ ｈｔｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｊｏｉｎｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｅｒｏｓｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｕｍａ－ 总之，ＴＷＥＡＫ作为新发现的致关节炎的细胞因子，在 ｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａａｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，２０１１，１３：ＲＳ１． ＲＡ、ＯＡ等关节炎的发病机制中起重要的作用，而 ［１２］ Ｚｈｅｎｇ ＴＳ，Ｂｕｒｋｌｙ ＬＣ．Ｎｏ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｅ：ＴＷＥＡＫ／ＦｎＩ４ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ＴＷＥＡＫ可能通过诱导软骨细胞合成ＭＭＰｓ从而在关 ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ—ｅｎｄ－ｏｒｇａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｅ Ｂｉｏｌ，２００８， 节软骨的破坏中起作用，阻断ＴＷＥＡＫ的作用将可能成 ８４：３３８－３４７． （收稿日期：２０１１－１１－０７） 为治疗上述疾病的一种策略。 （本文编辑：张志巍） （本文图片见光盘） 参考文献 ［１］管剑龙，施桂英．基质金属蛋白酶与骨关节炎．中华风湿病学杂 陈雾，陈悦，王梓，等．肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子在骨关节炎软骨细胞的表达及诱导产生ＭＭＰ＿９的研究意义［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电 子版，２０１２，６（１０）：２６１４－２６１７．
