利用_Red重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因_姜娜

生物技术通讯

Vol．20No．2Mar．,2009

173

doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．02．007

研究报告

利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因

姜娜，王芃，王艳春，袁盛凌，展德文，陶好霞，王令春，刘纯杰

军事医学科学院生物工程研究所，病原微生物与生物安全国家重点实验室，北京100071［摘要］

目的：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法：以伤寒沙门氏菌（SalmonellatyphiTy2，S．ty2）基

因组为模板扩增得到的同源臂，与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体；以重组载体为模板扩增打靶片段，将其转化S．ty2；在抗生素压力和λRed重组系统帮助下，打靶片段和菌体基因组发生同源重组，通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌；转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记，得到保留单一FRT位点的突变菌株；通过PCR鉴定重组菌，并经透射电子显微镜分析表型。结果：在S．ty2中敲除了rfaH基因，经PCR扩增和序列测定正确；初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论：获得了S．ty2突变株，为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。［关键词］

伤寒沙门氏菌；λRed重组系统；rfaH基因；基因敲除

［中图分类号］

Q78［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)02－0173－04

Knock－OutofrfaHGeneinSalmonellatyphiTy2byλRedRecombinationSystem

JIANGNa,WANGPeng,WANGYan－Chun,YUANSheng－Ling,ZHANDe－Wen,TAOHao－Xia,WANGLing－Chun,LIUChun－Jie

StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosafety,BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100071,China

［Abstract］

Objective:ToconstructrfaHgenedeletionmutantofSalmonellatyphiTy2(S．ty2)withλRedrecombination

HomologousregionsandkanamycincassettewithtwoFRTsiteswereamplifiedfromthecorresponding

Theresultantfragmentswere

andtherecombi-The

system．Methods:

templatesandwereinsertedintoplasmidpET22b－kanatoconstructarecombinantvector．ofλRedsystem,

thenamplifiedfromtherecombinantvectorandtransformedintoS．ty2．Underthepressureofantibioticandwiththework

homologousrecombinationoccurredbetweenthefragmentsandgenomeofhoststrain,

nantswereselectedonkanamycinagarplate．kanamycinresistantrelevantDNAfragment,crographs．

Results:

PlasmidpCP20wasintroducedintotherecombinanttoremovethe

Phenotypeanalysiswasperformedbytransmissionelectronmi-Phenotype

Conclusions:

TherfaHdeletionmutantof

resultinginasingleFRTsitewithinthetargetedgenomicsegment．

markerlessmutantstrainsweredetectedbygenomePCR．

rfaHgenedeletionmutantwasobtainedandidentifiedbyPCRmethodandsequencing．

analysisindicatedthattheflagellasynthesisofmutantdecreaseddramatically．

［Keywords］

SalmonellatyphiTy2wasobtained,anditwillbemodifiedfurthertobetheliveattenuatedbacterialvector．

SalmonellatyphiTy2;λRedrecombinationsystem;rfaHgene;geneknock－out

素和荚膜等的合成；同样，在鼠伤寒沙门氏菌（S．typhimurium）中，这个蛋白可以影响LPS核心区和O抗原的表达[8]。由此，我们推测，敲除沙门氏菌rfaH基因可以实现敲除多个沙门氏菌毒力基因的减毒效果。

在现代疫苗学研究中，沙门氏菌（Salmonella）常被用作疫苗载体。减毒沙门氏菌作为疫苗载体有诸多优点。首先，减毒沙门氏菌在遗传学上易于操作，以其作为载体曾表达过多种病原微生物抗原，并且可表达一种病原微生物的多个抗原[1－3]；其次，减毒沙门氏菌可引起广泛的免疫反应，既能引起黏膜免疫反应和系统免疫反应，又能引起细胞免疫反应；再次，此类疫苗载体可经口服或鼻饲途径免疫，这符合现代疫苗的观念与发展。以伤寒沙门氏菌（S．typhiTy2，S．ty2）为出发菌株一直是疫苗研究的一个热点，随着新的遗传学方法的建立，不断地有用这些方法对其进行减毒改造的文献报道[4－6]。

由rfaH基因编码的RfaH蛋白被认为是一种抗转录终止蛋白，它可以在细菌转录过程中协助RNA聚合酶越过ρ非依赖型转录终止子结构，实现下游基因的通读[7]。在大肠杆菌中，人们发现RfaH蛋白是一种毒力蛋白，它影响脂多糖（LPS）层、溶血

λRed体内重组技术是近年发展起来的一种基于同源重组原

理，在细菌染色体上对DNA进行直接修饰的新技术，可以在原核生物中实现精确、快速的基因敲除和基因敲入[9－10]。

在本研究中，我们利用λRed体内重组系统成功地在S．ty2中敲除了rfaH基因，并进行了PCR扩增、基因测序鉴定和表型分析。

［收稿日期］2008－10－09

［作者简介］姜娜（1981－），女，硕士研究生；王芃（1976－），女，助理研

究员；二者为共同第一作者

［通信作者］刘纯杰，（E－mail）liucj＠nic．bmi．ac．cn

1741

1．1

LETTERSINBIOTECHNOLOGY1．5

电击转化

生物技术通讯

Vol．20No．2Mar．,2009

材料与方法

材料

伤寒沙门氏菌S．ty2菌株购自军事医学科学院微生物流行

取2μLPCR产物与48μL感受态菌混合，将混合物加入

0．1cm的Bio－Rad电极杯中，设置电压1．8kV、脉冲25mF、电

阻200Ω；电击后迅速加入1mL预冷的LB液体培养基，37℃孵育1～2h；取200μL涂于卡那霉素（50μg／mL）LB平板上，37℃倒置培养，12～30h监测转化子的生长状况。

病学研究所；大肠杆菌宿主DH5α由本室保存；载体pKD46、

pCP20及原核表达载体pET22b由本室保存；插入卡那霉素

（Kan）抗性基因的载体pET22b－kana由本室构建和保存。性内切酶购自宝生物工程大连有限公司；Pfu聚合酶和Taq聚合酶购自天根生物工程有限公司；T4连接酶购自纽英伦生物技术有限公司；质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Promega公司；L－阿拉伯糖购自Sigma公司。

1．6全菌PCR鉴定含重组质粒的转化子

随机挑取数个克隆，在LB培养基中过夜培养，取菌液2．5

μL加入PCR小管中，在PCR仪中99℃热变性菌体5min；各管

中加入22．5μL除模板之外的PCR反应体系，采用引物krfaHf和krfaHr。PCR反应条件：94℃热变性40s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环。

1．2引物

本实验涉及到的引物所处位置如图1，序列见表1。

1．7卡那霉素抗性基因的去除

将编码FRT位点特异性FLP重组酶的质粒pCP20用电转

化法转化到鉴定正确的重组菌株中，取100μL涂于氨苄青霉素（100μg／mL）LB平板上，30℃倒置培养，获得阳性转化子；继而转接到没有抗生素的LB培养基中，42℃培养16h，连续传代3次，去除质粒；通过全菌PCR方法鉴定卡那霉素抗性去除情况。

图1

引物与基因组关系示意图表1引物序列

引物

序列（5＇3＇）

1．8透射电子显微镜对鞭毛的观察

分别挑取S．ty2和S．ty2△rfaH单菌落，接种于低盐培养基

中，37℃、220r／min振荡培养，使细菌培养液D600nm值约为0．3；取10μL细菌培养液滴加到覆盖有碳膜的铜网上，室温放置5

urfaHfurfaHrdrfaHfdrfaHrkrfaHfkrfaHrqrfaHfGCGGAATTCTTTCGGCGGCTCAGGTCGCGTCGACTGACTCTTATCCGCTTGTCCCAAGCTTGTTCAGAATACGACCTCACCGCTCGAGTCGCAATTTTTCCACGTAATTTACCCACTTCCCGT

AGGAGCAGGAGCGTGCCTTTCACAACTGCTGACGATAAATGCC

min，用吸水纸吸去多余的菌液，再滴加约10μL的磷钨酸染液，

室温放置30s，将多余染料吸去，稍稍干燥一下进行电镜观察。透射电镜工作电压为60kV。

2

2．1

结果

用于rfaH基因敲除的长同源臂外源DNA的构建

1．3打靶载体的构建

以S．ty2基因组为模板、引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，设计

引物urfaHf和urfaHr；用Taq聚合酶扩增rfaH基因上游约500

2．1．1PCR扩增同源臂经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增出

bp的片段，即rfaH上游同源臂；经EcoRⅠ／SalⅠ双酶切，连接到

经相同酶切的pET22b－kan载体上，转化DH5α，取连接正确的质粒进行测序，构建得到pET－kan－urfaH。按照相同的方法设计出下游同源臂的引物，将下游同源臂用HindⅢ／XholⅠ双酶切后与经同样的酶双酶切的质粒pET－kan－urfaH连接，最终得到pET－

的产物与目的片段大小一致（图2），上下游同源臂均为500bp。该片段纯化后用于构建打靶载体。

kan－rfaH。

将质粒pET－kan－rfaH用EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切，经胶回收试剂盒回收，便可获得两侧同源臂为500bp的线性打靶DNA；再以回收片段为模板，PCR扩增出打靶片段，经纯化得到高浓度的线性打靶DNA。

1．4Red基因的诱导表达和感受态细胞的制备

将编码Red重组系统的质粒pKD46用CaCl2法转化至伤寒沙门氏菌S．ty2中，30℃培养24h，在氨苄青霉素（Amp）为100

图2PCR扩增同源臂

：；MDNAMarker1：rfaH上游同源臂；2：rfaH下游同源臂

μg／mL的LB平板上筛选克隆，作为下一步转化的宿主菌；将此

宿主菌在含有Amp的高渗LB培养基中30℃过夜振荡培养，以

2．1．2打靶载体的鉴定将打靶载体pET－kan－rfaH用EcoRⅠ／

SalⅠ双酶切应得到约500bp的上游同源臂片段，用HindⅢ／XhoⅠ双酶切应得到约500bp的下游同源臂片段，结果如图3，

上下游同源臂均成功地连接到载体pET－kan上，同时测序鉴定结果也说明序列完全正确。

1∶100的接种量转接于50mL同样的培养基中，30℃振荡培养至D600nm约为0．6；在培养终止前1h加入终浓度为2mmol／L的L－

阿拉伯糖诱导Red重组蛋白的表达；离心收集菌体，用10％甘油洗3～4次，最后将菌体重悬于500μL冷的无菌10％甘油中，取

2．1．3高浓度打靶DNA的获得为了降低由质粒模板打靶产

50μL用于电击转化。

生的假阳性率，采用先酶切再扩增的方法获得打靶DNA。将打靶载体pET－kan－rfaH经EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切，以获得的2．5kb

姜娜等：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因片段作为模板，扩增得到高浓度打靶DNA；经DNA浓度定量分析，打靶片段浓度为17．5μg／mL。

175

消除温度敏感型质粒pCP20，这样我们获得的突变体不仅敲除了相应的基因，而且细胞内仅残留34bp的FRT位点，从而使后续研究的结果更为可靠。

将获得的阳性菌株于37℃振荡培养过夜，提取细菌基因组作为模板，以引物qrfaHf和krfaHr进行PCR验证，同时用S．ty2和S．ty2△rfaH::kan作为对照，结果如图5。可以看出，得到的重组菌用上述引物扩出的片段约1．2kb，与理论值完全一致；而2个对照扩增得到的片段分别约为1．7和2．7kb，这在基因水平上证实了rfaH基因被敲除。

2．2rfaH基因的敲除及PCR鉴定

经高渗培养基培养的S．ty2／pKD46菌株，按照1．4的方法电击转化；随机挑选在卡那霉素LB平板上生长出的单菌落11个，液体培养后做全菌PCR鉴定，结果如图4。与此相反，经LB培养的S．ty2／pKD46菌株，电击转化后并未得到阳性菌落。

用rfaH基因上游同源臂起始处的krfaHf引物和下游同源臂终结处的krfaHr引物对重组转化子进行PCR鉴定（图4）。结果表明，扩增得到2条片段，其一为1．5kb的片段，与以正常S．ty2为模板扩增的理论长度一致；其二为2．5kb的片段，与发生重组的菌基因组上这对引物间的理论长度一致，说明对应的菌株已经在rfaH基因位点发生了重组，1．5kb左右的卡那霉素基因盒线性化片段插入到了基因组中并替换了rfaH基因。将该2．5kb片段克隆到pT1－EASY载体中，进行克隆和测序，结果显示该序列的上下游分别含有rfaH基因上下游同源臂的片段，中间为卡那霉素抗性基因元件，这与理论目标相一致，说明重组成功，将新菌株命名为S．ty2△rfaH::kan。

从图4可以看出，在1～11号重组克隆中，除了第10号为假阳性外，其余克隆都得到了2．5kb特异性扩增带，可见此基因打靶的克隆阳性率非常高。

2．4rfaH基因缺失影响鞭毛合成

通过透射电镜直接观察细菌鞭毛的形态，发现S．ty2野生株具有长的周生鞭毛，而敲除株S．ty2ΔrfaH中鞭毛的数量大大降低（图6）。这些实验结果表明，rfaH基因缺失影响了RfaH蛋白的表达，进而影响了鞭毛合成。

抗性基因去除突变株全菌PCR鉴定

M：DNAMarker；1：S．ty2；2：S．ty2ΔrfaH::kan；3：S．ty2ΔrfaH

图5

打靶载体的双酶切鉴定

M：DNAMarker；1：pET－kan－rfaH＋EcoRⅠ／SalⅠ；

2：pET－kan－rfaH＋HindⅢ／XhoⅠ

图6

透射电镜观察S．ty2野生株与敲除株的细菌及鞭毛形态

A：S．ty2野生株；B：敲除株

图3

3讨论

由质粒pINT－ts改造得到的pKD46体内重组系统是以大肠

杆菌K12系菌株BW25113为宿主菌构建的，因此pKD46体内重组系统在源于K12的菌株中都得到了很好的应用[11－13]。但由于

重组子的全菌PCR鉴定

M：DNAMarker；1～11：各重组子的顺序编号

图4

伤寒沙门氏菌的生理生化特征与大肠杆菌K12系菌株有较大差别，使得在用于伤寒沙门氏菌时不能发挥质粒pKD46的重组功能，因此我们也对将λRed重组系统应用于伤寒沙门氏菌进行了实验条件的摸索。

首先，微荚膜的存在了外源DNA进入细胞。S．ty2的细菌存在微荚膜层，荚膜可以保护细菌免受外界恶劣条件的干扰，但也大大了外源DNA的进入，成为实现同源重组的首要屏障。为解决这个问题，我们尝试过多种方法，最后发现用去高渗培养基培养细菌不仅可以有效去除荚膜，而且不影响后续电击感受态的制备。高渗培养基可以提高外界的渗透压，有利于外源

2．3卡那霉素抗性基因的去除与验证

质粒pCP20表达的FLP重组酶能够识别卡那霉素抗性基因

两侧34bp的FRT位点，通过位点特异性重组将中间的抗性基因去除，仅在作用位点处留下一个单拷贝FRT位点。将pCP20电击转化入Kanr突变体株中，于30℃筛选到的KansAmpr菌株就是去除了卡那霉素抗性基因的突变体，再将其在42℃培养12h以

176

DNA进入细胞，而且由于微荚膜的存在使细菌容易集结在一起，

高渗培养基可以打破这种集结，使细菌分散开来，有利于提高外源DNA的打靶效率。实验证明这种去除荚膜的方法是有效的。除伤寒沙门氏菌外，很多致病菌都含有荚膜，如出血性大肠杆菌

[4]

LETTERSINBIOTECHNOLOGY

生物技术通讯

Vol．20No．2Mar．,2009

FEMS

gousantigenbyaregisteredSalmonellavaccine(STM1)[J]．MicrobiolLett,2003,227(2):211－217．

MelissaDD,TimothyT,HarryK,etal．Safetyandimmunogenici-tyofphoP／phoQ－deletedSalmonellatyphiexpressingHelicobacterpyloriureaseinadultvolunteers[J]．Vaccine,1999,18(5－6):449－459．

O157、炭疽杆菌等，这种去除荚膜提高转化效率的方法也值得在

这些细菌的操作中尝试。

其次，在S．ty2中长同源臂外源DNA有助于提高pKD46重组系统的重组效率。目前，大多数人认为利用Red重组系统进行基因敲除的优越之处在于所用同源臂可以短至30～50bp，因此可以用PCR的方法一步获得线性打靶DNA，而不必依赖于酶切连接等传统的基因工程手段，但实际情况并非总是如此。本组研究人员在实验中发现，整合在宿主菌染色体上的Red重组系统（如菌株DY330）比携带在质粒上的Red系统（如pKD46系统）有更高的同源重组效率，针对不同的菌株，DY330的重组效率要比pKD46系统提高102～103倍[14]。考虑到S．ty2与文献中经常采用的大肠杆菌K12株系亲缘关系较远，且有文献报道，应用长同源臂的方法在耶尔森菌中实现了靶基因的成功敲除[15]，因此我们将线性打靶DNA同源臂的长度由文献报道的40bp好的应用，获得了阳性重组株。

将λRed系统应用于S．ty2是一种新的有益的尝试，通过对各项条件的摸索试验，我们最终得到了rfaH突变株，这为将沙门氏菌进一步减毒突变改造成能用于临床应用的疫苗表达活菌载体奠定了基础。

[11]

[5]RichardS,NicolaDM,NickyJH,etal．Optimizationof

SalmonellaenteriaserovarTyphiΔaroCΔssaVderivativesasvehiclesfordeliveringheterologousantigensbychromosomalintegrationandinvivoinduciblepromoters[J]．InfectImmun,2005,73(1):362－368．[6]

MohamedIH,FlorianW,MichealH．RecombinantvaccinesbasedontranslocatedeffectorproteinsofSalmonellapathogenicityisland2[J]．Vaccine,2007,25(1):185－193．[7]

BaileyMJ,HughesC,KoronakisV．RfaHandtheopselement,componentsofanovelsystemcontrollingbacterialtranscriptione-longation[J]．MolMicrobiol,1997,26(5):845－851．[8]

NagyG,DaninoV,DobrindtU,etal．Down－regulationofkeyvir-ulencefactorsmakestheSalmonellaentericaserovarTyphimuriumrfaHmutantapromisinglive－attenuatedvaccinecandidate[J]．InfectImmun,2006,74(10):5914－5925．[9]

MurphyKC．

Useofbacteriophageλrecombinationfunctionsto

promotegenereplacementinEscherichiacoli[J]．Bacteriology,1998,180(8):2063－2071．

[10]YuD,EllisHM,LeeEC,etal．Anefficientrecombinationsys-temforchromosomeengineeronginEscherichiacoli[J]．AcadSciUSA,2000,97(11):5978－5983．

[11]DatsenkoKA,WannerBL．One－stepinactivationofchromosomal

genesinEscherichiacoliK－12usingPCRproducts[J]．

ProcNatl

AcadSciUSA,2000,97(12):60－65．

[12]王芃,袁盛凌,郑继平,等．一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营

养缺陷型的方法[J]．微生物学通报,2004,31:295－299．

延伸到

300～500bp，改进的方法果然在S．ty2菌的基因敲除中得到了很

ProcNatl

参考文献

[1]

ShahidAK,RichardS,TaoW,etal．SalmonellatyphiandS．ty-phimuriumderivativesharbouringdeletionsinaromaticbiosynthesisandSalmonellapathogenicityisland－2(SPI－2)andvectors[J]．Vaccine,2003,21(5－6):538－8．[2]

DarjiA,GuzmánCA,GerstelB,etal．OralsomatictransgenevaccinationusingattenuatedS．typhimurium[J]．Cell,1997,91(6):765－775．[3]

BachtiarEW,ShengKC,FifisT,etal．Deliveryofaheterolo-genesasvaccines

[13]袁盛凌,王芃,刘向昕,等．利用λ－Red重组系统和平衡致死系统

改造抗药性致腹泻工程疫苗[J]．微生物学通报,2006,33:10－15．

[14]王芃．致肾盂肾炎大肠杆菌基因的体内敲除和对毒力蛋白RfaH

功能的研究[D]．北京:军事医学科学院生物工程研究所,2006．

[15]DerbiseA,BilianaL,DenisD,etal．Arapidandsimplemethod

forinactivatingchromosomalgenesinYersinia[J]．MedMic,2003,38(2):113－116．

FEMSImmunol