辐射诱发支气管癌变细胞中p14_ARF_p16_INK4a_及BUB3基因甲基化

󰀁241󰀁

󰀁基础研究󰀁

辐射诱发支气管癌变细胞中p14、p16

及BUB3基因甲基化分析

󰀂高德伟󰀂周平坤

ARFINK4a

摘要!󰀂背景与目的󰀂肿瘤抑制基因的甲基化是发生肿瘤的重要机理之一,本研究通过检测p14ARF、p16INK4a及BUB3基因在辐射诱发的人支气管上皮细胞癌变株中的甲基化情况,探讨辐射诱发癌变的机理。方法󰀂用甲基特异性的PCR(MSP)分析基因启动子区CpG岛的甲基化情况,用RT󰀁PCR检测细胞的基因转录水平及DNA纯化、转化、测序。结果󰀂p14ARF基因在正常细胞中没有甲基化,但在其辐射诱发的癌变细胞中发生了甲基化。RT󰀁PCR结果进一步显示p14ARF基因的转录水平显著下降。与p14ARF基因共用2个外显子的p16INK4a基因则没有发生甲基化;BUB3基因在正常细胞及辐射诱发的癌变细胞中均没发生甲基化,并经测序证实。结论󰀂在辐射诱发的人支气管上皮细胞恶性转化中,共用两个外显子、与细胞周期调节有关的两个基因p14ARF与p16INK4a的甲基化不同步,甲基化的p14ARF基因出现转录抑制,而与有丝检测点相关的BUB3基因没有发生甲基化。

关键词!󰀂辐射󰀂󰀂人支气管上皮细胞󰀂󰀂细胞癌变󰀂󰀂基因󰀂󰀂甲基化 中图分类号!󰀂Q7

Abnormalpromotermethylationofp14ARF,p16INK4aandBUB3genesinmalignanttransformedcellsinducedbyradiation󰀂LIPeng*,GAODewei,ZHOUPingkun.*PLAGeneralHospital,Beijing100853,P.R.Chi󰀁na

Correspondingauthor:LIPeng,E󰀁mail:peng.lp@gmail.com

Abstract!󰀂Backgroundandobjective󰀂Themethylationoftumorsuppressorgenesisbelievedtobeoneofthemostimportantmechanismsofoncogenesis.Inordertoresearchthemalignanttransformedmechanisminducedbyradiation,theabnormalpromotermethylationofp14ARF,p16INK4aandBUB3genesaredetectedinthetransformedhumanbronchialepithelialcells(BEP2D)inducedby󰀁󰀁particles.Methods󰀂Abnormalpro󰀁motermethylationsweredetectedwithmethylationspecificPCR(MSP).Thelevelofp14ARFgenetranscrip󰀁tionwasanalyzedbyusingRT󰀁PCR.DNAwaspurifiedandtransformedandsequenced.Results󰀂p14ARFgenewasnotmethylatedinBEP2Dcells,butwasmethylatedinthemalignanttransformedBERP35T󰀁1cells,andthelevelofitstranscriptionwasdepressedremarkablyinthelatter.Howeverp16INK4agene,whichsharestwoexonswithp14ARFgene,wasnotmethylated.BUB3genewasnotmethylatedinBEP2DaswellasBERP35T󰀁1cellsandthiswasfurtherprovedbysequencinganalysis.Conclusion󰀂Themethylationoftwotumorsuppres󰀁sorgenes(p14ARFandp16INK4a)thatsharetwoexonsandcontrollcellcyclearenotsynchronousinthetrans󰀁formedhumanbronchialepithelialcellsinducedby󰀁󰀁particles,andthemethylatedone(p14ARF)isrepressedintranscription.Thegeneofmitosisspindlecheck󰀁point(BUB3)isunmethylated.

Keywords!󰀂Radiation󰀂󰀂Humanbronchialepithelialcellline󰀂󰀂Carcinogenesis󰀂󰀂Gene󰀂󰀂Methyl󰀁ation

󰀂󰀂在包括肺癌在内的许多恶性肿瘤中,一些肿瘤抑

制基因启动子的异常甲基化是经常发生的。本研究利用军事医学科学院放射医学研究所放射毒理研究室建立的󰀁󰀁粒子照射诱发人支气管上皮癌变细胞克隆为

作者单位:100853󰀂北京,中国人民总医院南楼呼吸科(、高德伟);军事医学科学院放射医学研究所放射毒理研究室(周平坤)(通讯作者:,E󰀁mail:peng.lp@gmail.com)实验模型,通过检测与细胞周期(p16、

p14ARF)和有丝检测点相关的(BUB3)肿瘤抑制基因启动子区的甲基化情况,以探讨辐射诱发癌变的机理。

1󰀂材料与方法

1.1󰀂细胞株󰀂BEP2D细胞是经过HPV󰀁18永生化的

[1,2]INK4a

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中国肺癌杂志2006年6月第9卷第3期󰀂ChinJLungCancer,June2006,Vol.9,No.3

人支气管上皮细胞,由NIH的HarryCC博士赠送。󰀁󰀁粒子照射诱发的人支气管上皮细胞恶性转化细胞株BERP35T󰀁1、BERP35T󰀁4由本实验室建立。细胞在LHC󰀁8无血清培养液(美国BiofluidsInc.)中于CO2孵箱中培养,温度为37∀。

1.2󰀂细胞DNA和总RNA提取󰀂采用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega公司)提取细胞DNA。用Trizol试剂(GibicoBRL)提取细胞总RNA,具体操作按试剂说明进行。

1.3󰀂甲基化特异PCR(MSP)[3]󰀂其基本原理是DNA序列中胞嘧啶(C)经过亚硫酸氢盐修饰处理后转变成尿嘧啶(U),而甲基化的C则不会发生这种改变。实验设计针对基因启动区CpG岛序列不同的PCR引物,通过PCR反应就可分析出所检测的序列是否发生甲基化。

1.3.1󰀂亚硫酸氢盐修饰󰀂取1~5󰀂g基因组DNA,溶于36󰀂L灭菌水中。用NaOH(终浓度0.3mol/L)变性,37∀15min。加入新鲜配置的3.6mol/L的NaHSO3416󰀂L和10mmol/L的氢醌24󰀂L,翻转混

合后,加入100󰀂L矿物油,55∀孵育16h。迅速放入-80∀冰箱中,10min后取出,吸出上面一层未冻的矿物油,用QIAGENPlasmidMiniKit中DNA纯化柱进行纯化,具体操作按说明书进行。用50󰀂L无菌水溶解纯化后的DNA,加入NaOH(终浓度0.3mol/L)37∀下处理15min,脱磺化,用10mol/L乙酸铵17󰀂L终止反应。加入2倍体积的无水乙醇,-20∀过夜,离心,沉淀,用80%乙醇漂洗两次,DNA溶于20󰀂L灭菌水中。

1.3.2󰀂PCR反应󰀂根据所检测基因启动子区CpG及两侧序列,设计合成甲基化和非甲基化引物个一套,具体基因和引物序列参见表1。PCR反应体系中包含10#PCRbuffer(Qiagen),dNTP(1.25mmol/L),引物(终浓度0.6󰀂mol/L),1个单位HotStarTaq酶(Qiagen)和亚硫酸氢盐修饰的DNA(约150ng),用PERKINELMERGeneAmpPCRSystem2400进行扩增,PCR反应条件参见表1。取10󰀂LPCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,UV灯下观察。

[4]

表1󰀂MSP的引物序列、退火温度和PCR产物大小

Tab1󰀂Summaryoftheprimersequences,annealingtemperaturesandPCRproductsizes

󰀂Genep16INK4ap14ARFBUB3

󰀂󰀂Forwardprimer(5∃󰀁3∃)

M:TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGCU:TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGTM:GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC

U:TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGTM:CGCGCTAAAACATCAACGTTCU:CACACTAAAACATCAACATTCAAG

󰀂󰀂Reverseprimer(5∃󰀁3∃)

M:GACCCCGAACCGCGACCGTAAU:CAACCCCAAACCACAACCATAAM:AAAACCCTCACTCGCGACGAU:CACAAAAACCCTCACTCACAACAAM:GGGATAGGGAGATAATTTTAGGATU:GGGATAGGGAGATAATTTTAGGAT

AnnealingProduct

temperature(∀)size(bp)

65655858

150151122132272275

M:methylated󰀁specificprimers;U:unmethylated󰀁specificprimers

1.3.3󰀂PCR扩增产物克隆和测序󰀂PCR产物琼脂糖电泳后,将特异的DNA条带回收和纯化,连接到

pGEM󰀁Teasy载体上(Promega公司),转化感受态大肠杆菌,挑选克隆,提取质粒,送上海基康生物技术有限公司测序。

1.4󰀂RT󰀁PCR󰀂根据Genbank注册的序列(U345)设计PCR引物,扩增p14ARF外显子1 远端和外显子2的一部分,约360bp(+173至+533)。引物序列为sense:5∃󰀁TTCTTGGTGACCCTCCGGATT󰀁3∃;anti󰀁sense:5∃󰀁CAGGCATCGCGCACGTCCAGC󰀁3∃。1.4.1󰀂cDNA第一链的合成󰀂以oligo󰀁dT(36)为引物,分别反转录合成BEP2D、BERP35T󰀁1、BERP35T󰀁4细胞的cDNA第一链。反应体系:总RNA5󰀂g,oli󰀁go󰀁dT(36)1󰀂g,RTbuffer6.0󰀂L,dNTP(250󰀂mol/L)6.0󰀂L,DTT1.5󰀂L,MMLV逆转录酶1.5󰀂L(100U/󰀂L)。反应条件为37∀、60min。

1.4.2󰀂PCR反应󰀂取上述cDNA第一链反应产物1󰀂L做模板,10#PCRbuffer(Qiagen)5󰀂L,dNTP(1.25mmol/L),引物(终浓度0.6󰀂mol/L),1个单位HotStarTaq酶(Qiagen),用PERKINELMERGene󰀁AmpPCRSystem2400扩增35个循环。每次PCR扩增反应中均以看家基因G3PDH的扩增反应(30个循环)作为内参照。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,通过自动凝胶成像分析系统观察并测定特异cDNA带的光密度值,以p14基因扩增产物与

ARF

G3PDH产物的比值来半定量分析p14基因mRNA表达水平。2󰀂结果2.1󰀂p16INK4a

ARF

、p14ARF

和BUB3基因在BEP2D和癌变中国肺癌杂志2006年6月第9卷第3期󰀂ChinJLungCancer,June2006,Vol.9,No.3

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BERP35T󰀁1细胞株中甲基化检测结果󰀂本实验共设计了3对甲基化引物和3对非甲基化引物,以经过亚硫酸氢盐修饰的BEP2D和BERP35T󰀁1细胞基因组DNA分别为模板,对上述3个基因启动子区CpG岛

序列进行PCR扩增,分析DNA甲基化。结果显示p14基因在BEP2D细胞中没有甲基化,但在其癌变细胞BERP35T󰀁1中发生了甲基化;p16INK4a和BUB3基因在两株细胞中均未发生甲基化(图1)。

ARF

图1󰀂p14ARF、p16INK4a和BUB3基因在BEP2D(B)与BERP35T󰀁1(T1)细胞中非甲基化(U)和甲基化(M)PCR产物的电泳图

Fig1󰀂TheunmethylatedandmethylatedPCRproductsamplifiedfromp14ARF,p16INK4aandBUB3genesinBEP2D(B)andBERP35T󰀁1(T1)cells

2.2󰀂亚硫酸氢盐修饰后BERP35T󰀁1细胞基因组DNA的BUB3启动子区非甲基化扩增产物的序列分析󰀂对BUB3启动子区非甲基化扩增产物进行克隆和

测序(图2),结果显示,经过亚硫酸氢盐处理后,包括

CpG在内的原序列中的C全部被修饰,具体体现在非甲基化扩增产物的测序结果为T,说明本实验亚硫酸氢盐修饰反应完全,结果可靠,同时也表明BUB3启动子区确实未发生甲基化。

图2󰀂经过亚硫酸盐修饰后扩增的BERP35T󰀁1细胞BUB3基因启动子的部分测序结果(第1行为原序列,第2行为修饰后序列)Fig2󰀂PartofsequencinganalysisofBUB3genepromoteramplifiedfromthebisulfite󰀁treatedgenomicDNAofBERP35T󰀁1cells

(Thefirstline:originalsequences;thesecondline:bisulfite󰀁modifiedsequences)

2.3󰀂p14

ARF

在BEP2D和癌变细胞中的表达分析󰀂情况下处于非甲基化状态,它的异常甲基化将导致基因转录的静止。目前已在人类多种癌症确定的部分肿瘤抑制基因转录失活与DNA甲基化密切相关。而肿瘤抑制基因CpG岛的甲基化是肺癌发病机理中最常见的机制之一。

已有研究证实DNA甲基化是p14ARF基因异常的主要机制,同时5∃CpG岛的甲基化在INK4a/ARF位点的改变中扮演了重要的角色[5]。位于人类染色体9p21的INK4a/ARF位点编码两个不同的蛋白质,p14ARF与p16INK4a,这两个蛋白质是由不同的读码框架翻译而成。p16INK4与p14ARF共用两个外显子,ex󰀁on2和exox3,但二者外显子1的转录本不同,分别为RT󰀁PCR检测结果发现,在同样的模板条件下,经过同时扩增管家基因G3PDH的模板量标定,与BEP2D细胞相比,癌变细胞BERP35T󰀁1、BERP35T󰀁4几乎无p14ARF基因的cDNA扩增产物(图3)。3󰀂讨论

DNA甲基化改变已经被认为是人类癌症中最经常发生的改变之一。它对染色体的结构、基因表达、DNA复制等的时间控制均有重要影响。在许多基因的启动子区或其附近存在的CpG富集区,俗称CpG岛,它是最常见的DNA甲基化位点。这些基因正常󰀁244󰀁

中国肺癌杂志2006年6月第9卷第3期󰀂ChinJLungCancer,June2006,Vol.9,No.3

BUB3蛋白与BUB1蛋白具有协同作用,因此BUB3基因的改变是肿瘤形成的一个候选因素。人类BUB3基因启动子与许多管家基因有相同的特征,包括一个GC富集区和缺失一个功能TATA组份。BUB3基因启动子区的特征性结构在这个基因转录调节中扮演重要角色[9]。本研究发现通过辐射诱发的癌变细胞系中存在纺锤体检测点功能缺陷,所以笔者对BUB3基因的启动子区进行甲基化分析,但未发现其在BEP2D

图3󰀂p14ARF在BEP2D细胞(B)和其癌变细胞BERP35T󰀁1(T1)、BERP35T󰀁4(T4)中表达的RT󰀁PCR分析Fig3󰀂TheexpressionofbyRT󰀁PCR

p14ARF

geneinBEP2D(B)anditsmalignant

transformedcelllinesBERP35T󰀁1(T1)andBERP35T󰀁4(T4)analyzed

和辐射诱发的癌变细胞中发生甲基化。为检测实验方法和实验结果的可靠性,对BUB3基因的PCR产物进行了测序,结果发现所有经亚硫酸氢盐修饰的胞嘧啶均转变成尿嘧啶,充分说明BUB3基因启动子区的胞嘧啶未被甲基化。由此也说明癌变细胞的纺锤体检测点功能异常不是由于BUB3基因CpG岛甲基化引起的,可能存在其他原因。

参󰀂考󰀂文󰀂献

1󰀂LouTZ,XiangXQ,WuDC.TransformationofhumanbronchialepithelialcellsBEP2Dinducedby238Pu󰀁󰀁particles.ChinJLungCanc󰀁er,2000,3(6)%428󰀁431.[楼铁柱,项晓琼,吴德昌.238Pu󰀁粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究.中国肺癌杂志,2000,3(6)%428󰀁431.]

2󰀂SuiJl,LiuXL,HuYC,etal.Sub󰀁cloningofmalignanttransforma󰀁ntsofBEP2Dinducedby󰀁󰀁particlesandtheircapacityofrejoiningDNAdouble󰀁strandbreaks.CarcinogenTeratogenMutagen,2002,14(1)%5󰀁9.[隋建丽,刘秀林,胡迎春,等.󰀁󰀁粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究.癌变󰀁突变󰀁畸变,2002,14(1)%5󰀁9.]

3󰀂HermanJG,GraffJR,MyohanenS,etal.Methylation󰀁specificPCR:anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(18)%9821󰀁9826.

4󰀂Zochbauer󰀁MullerS,FongKM,VirmaniAK,etal.Aberrantpro󰀁motermethylationofmultiplegenesinnon󰀁smallcelllungcancers.CancerRes,2001,61(1)%249󰀁255.

5󰀂HsuHS,WangYC,TsengRC,etal.5&cytosine󰀁phospho󰀁guanineislandmethylationisresponsibleforp14ARFinactivationandinverselycorrelateswithp53overexpressioninresectednon󰀁smallcelllungcanc󰀁er.ClinCancerRes,2004,10(14)%4734󰀁4741.

6󰀂SherrCJ.ThePezcollerlecture:cancercellcyclesrevisited.CancerRes,2000,60%36󰀁3695.

7󰀂SherrCJ,WeberJD.TheARF/p53pathway.CurrOpinGenetDev,2000,10(1)%94󰀁99.

8󰀂LewDJ,BurkeDJ.Thespindleassemblyandspindlepositioncheckpoints.AnnuRevGenet,2003,37%251󰀁282.

9󰀂BaekWK,ParkJW,LimJH,etal.Molecularcloningandcharac󰀁terizationofthehumanbuddinguninhibitedbybenomyl(BUB3)pro󰀁moter.Gene,2002,295(1)%117󰀁123.

(收稿:2005󰀁07󰀁13󰀂󰀂修回:2005󰀁09󰀁24)

exon1󰀁和exon1 ,启动子区也不同。二者的作用通

路亦不同,前者通过p16INK4a/细胞周期素D1/细胞周期依赖性蛋白激酶4/RB通路抑制细胞增殖,后者则通过p14/MDM2/P53引起细胞生长阻滞或凋亡[7]。本实验通过对两个基因的甲基化分析表明,p16在BEP2D和BERP35T󰀁1细胞中均没发生甲基化,而p14ARF在BEP2D细胞中没有发生甲基化,在癌变细胞中则发生了甲基化,RT󰀁PCR结果表明其在肿瘤细胞中mRNA的转录水平受到明显抑制。这也进一步说明p16INK4a和p14ARF的作用通路不同,失活不同步,再一次验证了p14ARF的细胞周期阻止活性并不依赖p16。同时笔者推测p14启动子区CpG岛的甲基化导致该基因的转录失活,可能在辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化中起着重要作用。

真核生物已经形成了有丝检测点,该检测点能够监视有纺锤体缺陷的细胞进行有丝,从而确保复制的染色体精确分离[8]。肿瘤细胞中有丝检测点的改变能促进基因组的不稳定性,而基因组的不稳定性是癌细胞的特征。BUB3是近几年新发现与有丝纺锤体检测点有关的基因。BUB3基因位于10q26,人类的BUB3基因有7个外显子和6个内含子,分子量16kb,大多数外显子与内含子的交界处位于保守位点。BUB3基因编码一个37ku蛋白,是BUB1的酶基质,在着丝粒󰀁微管连接前,BUB3定位到着丝粒上,从而使BUB1定位到着丝粒上。在BUB3缺失的情况下,BUB1无法定位到着丝粒上。BUB3基因敲除大鼠的研究表明BUB3是细胞进行正确有丝所必需的纺锤体检测点通路中的一个组份。最近在结肠癌中已发现BUB1基因突变,这些突变的BUB1基因促使了人类细胞染色体的不稳定性。INK4a

ARF

INK4a

ARF

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(本文编辑󰀂张世雯)