・ １０ ・ 《上海畜牧兽医通讯》２０１０年第１期 维生素Ｂ１对山羊瘤胃微生物体外发酵的影响 张红伟 王洪荣 刘 翔 曹维维 董淑红 王剑飞 张建智 （扬州大学动物科学与技术学院 江苏扬州 ２２５００９） 【摘要】以３头安装有永久性瘤胃瘘管的徐淮白山羊羯羊作为瘤胃液供体，可溶性淀粉、小麦淀粉、粉碎的滤纸 纤维、木聚糖和果胶作为底物，精粗比为３０：７０，利用人工瘤胃体外培养法，研究不同浓度的维生素Ｂ１（０、１０、２０、３０、 ４０ ｍｇ／ｋｇ）对瘤胃微生物体外发酵的影响。结果表明：低精料日粮条件下，随着维生素Ｂ１添加量的增加，培养液的 ＤＨ呈上升趋势，ＮＨ 一Ｎ的平均浓度极显著提高（Ｐ＜０．０１）；降低了乙酸浓度、丙酸浓度和ＴＶＦＡ浓度，提高了丁酸 浓度；体外发酵２４ ｈ时，１Ｏ、２０、３Ｏ ｍｇ．／ｋｇ处理组降低了“乙／丙”；改变了瘤胃发酵类型。 关键词：维生素Ｂ ；瘤胃微生物；体外培养 维生素Ｂ （ｔｈｉａｍｉｎ），又名硫胺素，是人类最早发现的一 种水溶性维生素。ＶＢ 通过辅酶形式（ＴＰＰ）参与由酮酸氧 化脱羧酶、丙酮酸脱氢酶等催化的碳水化合物及碳水化合物 合成脂肪的反应，是机体通过羧酸代谢从养分中获得能量所 必需的。传统观念认为反刍动物瘤胃中能合成ＶＢ 并能满 足其营养需要，所以关于反刍动物ＶＢ。的研究很少。然而， 随着近年来反刍动物品种的改良、生产性能的显著提高，研 究发现在一些情况下需要在反刍动物日粮中添加ＶＢ。｛ｔ ３，因 而关于ＶＢ 等Ｂ族维生素的研究再次引起关注。为此，本试 验采用体外法探讨低精料Ｈ粮条件下ＶＢ 对瘤胃发酵的影 响，以期在生产中的应用提供理论基础。 １材料与方法 １．１试验动物 ３头装有永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊，采用栓系式饲养 方式，自由饮水，用于采集瘤胃液。 １．２ 瘤胃液的采集 在山羊早饲前，利用自制真空负压装置，３头瘘管羊分别 各采集瘤胃液２００ ｍｌ，经４层纱布过滤，装入保温瓶，迅速带 回实验室，通Ｃ０１，置于３９℃水浴中保温。 １．３培养液 人工唾液盐参照Ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ Ｌ Ａ（１９９７）等 ２的方法配 制（见表１）。将瘤胃液与人工唾液盐按照１：２的比例混匀， 厌氧条件下，３９℃水浴保温，备用。 表１ 人工唾液盐的组成 Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ｇ／Ｌ） ＮａＨＣＯ ９．２４０ Ｎａ２ＨＰＯｄ’１２Ｈ２０ ７ １２０ Ｎａ２ＳＯ４ ０ ｌ９４ ＮａＣｌ ０．６２７ Ｕｒｅａ ０．９４０ ＊Ｆｏｒ ａｌｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；ｍａｊｏｒ ｍｉｎｅｒａｌｓ（ｇ／Ｌ）：ＣａＣＩ２’２Ｈ２Ｏ ０．０７３， ＭｇＣｌ２’６Ｈ２０ ０．１００，ＫＣ１ ０．４５；ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ｍｇ／Ｌ）：ＦｅＣＩ２－４Ｈ２Ｏ ２０ ５，ＭｎＣｌ２。４Ｈ２０ ２２．１５，ＺｎＳＯ４。７Ｈ２０ ４．４，ＣｏＣｌ２。６Ｈ２Ｏ １．２，ＣｕＳＯ４ 。５Ｈ２Ｏ ０．９８，Ｍｏｖ（ＮＨ４）６Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０ １７４；ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎｓ （ｍｇ／Ｌ）：ｖａｌｉｎｅ ｌ１，ｌｅｕｃｉｎｅ １３，ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ １３，ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ ０ ５，ｂｉｏｔｉｎ ０．０１，Ｐ～ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ０ ２。ｐｔｅｒｏｙｉｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ０ ０５，ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ２， ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ ２，ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ２，ｐｈｙｌｌｏｑｕｉｎｏｎｅ ０．１，ｎｉａｃｉｎ ２，ｃｂｏ￣ｅ ７５。 １．４试验设计 采用单因子五水平试验设计。维生素ＢＩ以盐酸硫胺素 的形式添加，水平为对照组Ａ组（０ ｎ塔／ｋｇ）、Ｂ组（１０ ｍｇ／ｋｇ）、 ＊为通讯作者。 Ｃ组（２０ ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ组（３０ ｍｇ／ｋｇ）、Ｅ组（４０ ｍｇ／ｋｇ）。体外培 养底物为粉碎的滤纸纤维、果胶、木聚糖、小麦淀粉和可溶性 淀粉组成的精粗比为３Ｏ：７０的半纯合日粮。 １．５ 测定指标与方法 １．５．１培养液ｐＨ值：用ｐＨＳ一３Ｃ镭磁型酸度计在每次采 样后立即测定ｐＨ值。 １ ５．２ ＮＨ 一Ｎ：采用酚一次氯酸钠比色法Ｉ３］。 １．５．３ 培养液微生物真蛋白的测定：采用三氯醋酸（ＴＣＡ） 沉淀蛋白法Ｈ 。瘤胃液经１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ高速离心１０ ｍｉｎ，弃 上清液加入５ ｍｌ １０％三氯乙酸（ＴＣＡ），混匀，置室温３０ ｒａｉｎ 后经４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清液加入５ ｍｌ ５％ＮａＯＨ 混匀溶解后，经４ ０００ ｒ／ａｒｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液进行样品 分析，用７５６型紫外分光光度计进行测定波长，分别为 ０１３２蛐ｎｎｌ和０Ｉ）２∞ｎｍ值。 Ｐｒ（ｍｇ／ｍ１）：（１．４５＊ＯＤ２８０—０．７４０＊ＯＤ２６０）＊稀释倍数 Ｐｒ：微生物真蛋白的含量，单位：ｍｇ／ｍｌ；ＯＤｅ 瘤胃液在波长 为ＯＤｅ 。时的测定值；ＯＩ）２ 。：瘤胃液在波长为ＯＤｅ６。时的测定值。 １．５．４挥发性脂肪酸（ＶＦＡ）：采用日本岛津ＧＣ一１４Ｂ气相 色谱仪依内标法进行测定。Ｈ本岛津ＧＣ一１４Ｂ气相色谱仪 测定 Ｊ：测定条件为毛细管柱ＣＰ—ＷＡＸ（长３０ ｍ，内径 ０．５３ ｈｉｍ，膜厚１ ｎ１）；气化室温度２００℃，ＦＩＤ检测器温度 ２００℃；柱温采用程序升温法，初温１００℃，末温１５０℃，升温 速率３℃／ｍｉｎ，灵敏度为ｌＯ ．衰减为２ ，以巴豆酸为内标物。 瘤胃液处理：瘤胃液经１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后，取上清 液１ ｍｌ，加０．２ ｍｌ ２０％含６０ ｍＭ巴豆酸的偏磷酸，混匀后高 速离心，取上清液０．４ Ｉ进样分析。 １．６ 数据统计 采用Ｅｘｃｅｌ软件整理数据，运用ＳＰＳＳ１３．０软件进行统计 分析，差异显著性采用ＬＳＤ法进行多重比较。 ２结果与分析 ２．１ 不同浓度维生素Ｂ 对瘤胃微生物体外发酵各 指标的影响 表２不同浓度维生素ＢＪ对瘸胃微生物体外发酵２４ ｈ的影响ｌ平均值 注：同行字母相同或不标注者表示差异不显著（Ｐ＞０ ０５），相邻字母表 示差异显著（Ｐ＜Ｏ ０５），相隔字母表示差异极显著（Ｐ＜０．０１）。下表同。 《上海畜牧兽医通讯》２０１０年第１期 ・ ｌｌ ・ 由表２可知，与对照组相比，各维生素Ｂ 试验组培养液 中ｐＨ值均升高，且１０ ｍｇ／ｋｇ处理组与对照组相比差异极显 著（Ｐ＜０．０１），２０ ｍｇ／ｋｇ、４０ ｍｇ／ｋｇ处理组与对照组相比差 异显著（Ｐ＜０．０５），但３０ ｍｇ／ｋｇ处理组与对照组相比差异不 显著（Ｐ＞０．０５）。各试验组培养液中ＮＨ 一Ｎ浓度极显著提 高（Ｐ＜０．０１），且随维生素Ｂ。添加量的升高而增加。各试验 组的原虫真蛋白浓度均上升，但与对照组相比差异不显著 （Ｐ＞０．０５）；细菌真蛋白浓度均下降，其中２０、３０、４０ ｍｇ／ｋｇ 处理组与对照组相比差异显著（Ｐ＜０．０５）。 ２．２不同浓度维生素Ｂ 对瘤胃微生物体外发酵中 ＶＦＡ浓度的影响 表３不同浓度维生素Ｂ 对瘤胃微生物体外发酵中ＶＦＡ浓度的影响 由表３可见，随着发酵时间的延长，试验组与对照组的培养 液中的乙酸浓度、丙酸浓度、丁酸浓度和ＴⅥ１Ａ浓度均呈上升趋 势；乙俩总体呈下降趋势。试验组发酵终点培养液中，乙酸浓 度、丙酸浓度和ＴＶＦＡ浓度极显著低于对照组（Ｐ＜０．０１）； ２０ ｍｇ／ｋｇ￣验组丁酸浓度显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），４０ ｍｇ／ｋｇ 试验组极显著高于对照组（Ｐ＜０．０１），３０ Ｅｎｇ／ｋｇ试验组丁酸 浓度高于对照组，但差异不显著（Ｐ＞０．０５）；而１０ ｍｇ／ｋｇ试 验丁酸浓度显著低于对照组（Ｐ＜０．０５）。０～４ ｈ内，各试验 组乙／Ｎ与对照组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）；８～１２ ｈ，与对 照组相比，各试验组乙／ｒｇ均升高；２４ ｈ时，１０、２Ｏ、３０ ｍｇ／ｋｇ 试验组乙／Ｎ均降低，但差异不显著（Ｐ＞０．０５），而４０ ｍｇ／ｋｇ 试验组乙俩显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）。 ３讨论与小结 维生素Ｂ 是反刍动物维持机体正常生理功能所必需的 一种水溶性维生素，它对反刍动物正常生命活动及生长都具 有重要意义。维生素Ｂ１的主要功能是参与碳水化合物代 谢，若缺乏，碳水化合物就不能进行正常代谢，丙酮酸和乳酸 在体内积聚，ｐＨ值下降，造成神经系统、血液循环、消化系统 等的机能障碍。当前有关维生素Ｂ，对瘤胃微生物体外发酵 的影响研究极少。 本研究发现，在发酵底物为低精料日粮的体外培养液中 添加维生素Ｂ ，能够提高培养液ｐＨ值。ｐＨ是衡量瘤胃内 环境稳定的一个重要指标，维生素Ｂ．能提高ｐＨ并维持在正 常的范围内，对反刍动物瘤胃发酵具有重要意义。氨是瘤胃 中主要微生物体系生长的氮源【６ｊ，瘤胃ＮＨ 一Ｎ浓度也是瘤 胃内环境参数的一个重要指标，反映了瘤胃内微生物氮的供 应状况。适宜的ＮＨ 一Ｎ浓度（０．３５～２９ ｍｇ／１００ｍ１）有利于 瘤胃微生物蛋白的合成。在本试验条件下，添加维生素Ｂ１ 后，培养液ＮＨ 一Ｎ浓度均在最佳浓度范围内，但是随着维 生素Ｂ，添加量的增加而升高。产生此结果的原因有两种可 能：一是低精料日粮条件下，维生素Ｂ 不能够促进瘤胃微生 物对ＮＨ 一Ｎ的利用，以产生细菌蛋白，这与结果中细菌蛋 白浓度降低、原虫蛋白浓度升高相一致；二是培养液中的蛋 白质源降解增加。Ｆｒｓｋｏｗ等（１９７９）＂ 报道，饲料蛋白质在以 粗饲料为基础日粮条件下的降解率较高。瘤胃中碳水化合 物发酵的主要终产物是乙酸、丙酸和丁酸等ＶＦＡ（挥发性脂 肪酸），其含量和组成是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标。 本试验结果表明，体外培养液中添加维生素Ｂ．可降低 乙酸浓度、丙酸浓度和ＴｖＦＡ浓度，提高丁酸浓度；２４ ｈ时， １Ｏ、２０、３０ ｍｇ／ｋｇ试验组维生素Ｂ 降低了乙／Ｎ，改变了瘤胃 发酵类型。ＴＶＦＡ浓度与瘤胃微生物对日粮中碳水化合物 的降解有密切关系，ＴＶＦＡ浓度降低，说明维生素Ｂ．不能够 提高日粮中碳水化合物在培养液中的降解程度。综合各项 发酵指标，建议在低精料日粮条件下可以不添加维生素Ｂ，。 参考文献 （１］Ｚｉｍｍｅｒｌｙ Ｃ Ａ，Ｗｄｓｓ Ｗ Ｐ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｄｉｅｔａｒｙ ｂｉｏｔｉｃ ｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｈｏｌｓｔｅｉｎ ＣＯＷＳ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｌａｃｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，８４：４９８～５０６． ［２］Ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ Ｌ Ａ，Ｊｅａｎ—Ｂｌａｉｎ Ｃ，Ｋｏｍｉｓａｒｅｚｕｋ—Ｂｏｎｙ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｃｒｏ— ｂｉａｌ ｔｈｉａｍｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎｔｈｅ ｒｕｍｅｎ ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｉｄｏ—ｇｅｎｉｃ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ，ａ ｈｉｇｈ ｓｕｌｆｕｒ ｌｅｖｅｒｌ ａｎｄ ａｄｄｅｄ ｔｈｉａｍｉｎ． Ｂｒｉｉｔｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９９７，７８（４）：５９９～６１３． ［３］冯宗慈，高民．通过比色法测定瘤胃液氨氮含量方法的改进［Ｊ］． 内蒙古畜牧科学，１９９３，（４）：４Ｏ～４１． ［４］王宁娟．人工瘤胃法研究矿物质元素及非蛋白氮对瘤胃发酵的影 响［Ｄ］．杨陵：西北农林科技大学，２００３． ［５］熊本海，卢德勋，高俊．绵羊瘤胃ＶＦＡ吸收效率及模型参数的研 究［Ｊ］．动物营养学报，１９９９，１１：２４８～２５５． ［６］Ｂａｎｄｌｅ Ｓ，Ｇｕｐｔａ Ｂ Ｎ．Ｒｕｍｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｔｏｔａｌｖｏｌａｔｉｌｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ（ＴＶＦＡ）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ ｆｅｄ ｏｎ ｕｒｅａ— ｍｏｌａｓｓｅｓ—。 ｍｉｎｅｒａｌｂｌｏｃｋｌｉｃｋｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ａｎｉｍ Ｆｅｅｄ—Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ，１９９７，（６５）： ２７５——２８６． 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