伊犁马在四个微卫星位点上的遗传多样性分析

农业科学２００８，４５（３）：５７５—５７８　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　伊犁马在四个微卫星位点上的遗传多样性分析　李红　，黄锡霞　，姚新奎　，苟荣　，谭晓海２，努尔巴哈提２，马＂２ｒ－￣２，　刘珩　，玉山江　，叶在华　（１．农业大学动物科学学院，鸟鲁木齐８３００９１；２．伊犁昭苏马场，昭苏８３５６００）　摘要：通过四个微卫星位点对伊犁马进行了遗传检测，用８％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离ＰＣＲ扩增产　物。统计该群体的等位基因的组成、等位基因数。利用等位基因频率计算出多态信息含量、杂合度及其平均　值。结果表明四个微卫星位点在伊犁马中的平均多态信息含量为０．６９７　３，属高度多态，可作为有效的遗传标　记用于伊犁马遗传多样性的分析。　关键词：伊犁马；微卫星；遗传多样性；多态信息含量；杂合度　中图分类号：￥８２１．８３；Ｓ１２４．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—４３３０（２００８）ｏ３—０５７５—０４　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｔ　Ｆｏｕｒ　Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｌｏｃｕｓ　ｏｆ　ｌｌｉ　Ｈｏｒｓｅ　ＬＩ　Ｈｏｎｇ　，ＨＵＡＮＧ　Ｘｉ—ｙａ　，ＹＡＯ　Ｘｉｎ—ｋｕｉ　，ＧＯＵ　Ｒｏｎｇ　，ＴＡＮ　Ｘｉａｏ—ｈａｉ２，Ｎｕｅｒｂａｈａｔｉ２　ＭＡ　Ｊｉａｎｇ—ｆｅｉ２。ＬＩＵ　Ｈｅｎｇ　，Ｙｕｓｈａｎｊｉａｎｇ　，ＹＥ　Ｚａｉ—ｈｕａ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５２，Ｃｈ／ｎａ；２．Ｘｉｎｊｉａ￣Ｚｈａｏｓｕ　Ｓｔｕｄ，Ｚｈａｏｓｕ　Ｘｉｎｆｉａｎｇ　８３５６０２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｏｆ　４　ｍｉｃｍｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｌｌｉ　ｈｏｒｓｅ．ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　８％ｎｏｎｄｅｎａｔｕｆｉｎｇ　ＰＡＧＥ．Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｌｌｅｌｅｓ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｗｅｌ＇￣ｃｏｕｎｔｅｄ．　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　４　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｌｏｃｕｓ，Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ（ＰＩＣ），ｈｅｔｅｍｚｙｇｏｓｉｔｙ（Ｈ）　ａｎｄ　Ｉｌ；ｌｅｉｒ　ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｉｅｄ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ＰＩＣ　ｏｆ　４　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｉｌｉｔｅ　Ｌｏｃｕｓ　ｗｅｒｅ　０．６９７　３，ｗｈｉｃｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅｓｅ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｉｌｉｔｅ　Ｌｏｃｕｓ　ｗｅｒｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎⅡｊ　ｈｏｒｓｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：１］ｉ　ｈｏｒｓｅ；ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＰＩＣ；ｈｅｔｅｒｐｚｙｇｏｓｉｙｔ　伊犁马是我国著名的培育品种之一，是我国独特的马遗传资源。其因主产于维吾尔自治区的　伊犁哈萨克自治州而得名，中心产地在昭苏、特克斯、尼勒克、新源、巩留等县境内。伊犁种马场、昭苏马　场为伊犁马的核心育种场。２０世纪初期，伊犁马是以哈萨克马为母本，陆续与奥尔洛夫马、布琼尼马、　顿河马、阿哈捷金马等通过多种杂交方式，在放牧主条件基本不改变的情况下，经过长期杂交改良、选育　而成。其具有较高的繁殖性能，耐粗饲、耐严寒、抗病力强，有较广泛的适应能力，运动性能居于国产马　前列。其原为乘挽兼用品种，主要是以乘为主，兼顾挽用类型。近些年来，随着社会经济发展的需要，正　在通过引进乘用马品种进行杂交改良，向乘用马方向选育。　微卫星（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）是一类散在分布于整个基因组中的短串联重复序列，又称简单重复序列　（Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｕｑｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｓｔ，ＳＳＲ），其核心序列是２　６　ｂｐ的短核苷酸重复１Ｏ一２０次，并与两侧的侧翼序列　构成了微卫星座位。微卫星具有数量多，分布广，多态性丰富，呈共显性遗传以及检测快速方便等优点。　微卫星技术已在许多家畜上应用，但在马上应用较少，特别是在伊犁马的遗传多样性研究方面，国内外　未见报道。因此，研究旨在通过微卫星标记来分析伊犁马的遗传多样性，以期今后为伊犁马的合理利用　积累基础资料。　收稿日期：２００８—０３—０５　基金项目：国家科技部国际科技合作重点项目“乳用马品种引进及杂交改良初步试验研究”（２００５ＤＦＡ３０７６０）；维吾尔自治区重点攻关　项目“引进乳用马品种开展杂交改良试验研究”（２００５４１１０１）　作者简介：李红（１９７９一），女，奇台人，在读硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖　通讯作者：姚新奎（１９６１一），男，奎屯人，教授，硕士研究生导师，研究方向为动物遗传育种与繁殖，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｙｘｋ６１＠１２６．ｅｏｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com

・５７６・　农业科学　４５卷　ｌ材料与方法　１。１　材料　试验采集伊犁地区昭苏马场的伊犁马血样４１匹份，用ＥＤＴＡ・Ｋ２抗凝，一２０￣Ｃ保存备用。　１。２方法　１．２．１基因组ＤＮＡ的提取　用常规酚一氯仿法提取基因组ＤＮＡ；长期保存在ｒＩＥ缓冲液中（一２０￣Ｃ保存）；用前ｒＩＥ稀释，４￣Ｃ保　存备用。　１。２。２微卫星位点的选择及引物的合成　根据Ｂａｒｋｅｒ［　］微卫星选择标准及相关文献提供马的微卫星引物序列，由上海生工生物工程技术服　务有限公司合成４对引物。表１　表１　四个微卫星位点的引物序列　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　４　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　１．２．３微卫星位点ＰＣＲ反应体系及反应程序　微卫星位点ＰＣＲ反应程序：９５￣Ｃ预变性５　ｍｉｎ；３０个循环（９４￣Ｃ变性３５　ｓ；５６￣Ｃ　６０￣Ｃ退火复性３０　ｓ；　７２％延伸４０　ｓ）；７２￣Ｃ延伸１０　ｍｉｎ；４％保存。引物不同ＰＣＲ反应条件略不同。表２　表２微卫星位点的ＰＣＲ反应体系组分（２０　）　Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　组分Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　体积Ｖｏｌｕｍｅ（止）　灭菌ｆ１ｄＨ２０　ｌ２．８５　１０×ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍ　）　２．００　＆ＮＴＰｓ（２．５　ｍｍｏｌ／Ｉ　）　２．００　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅ（１０　ｐｍｏｌ／／￣Ｌ）　ｌ。００　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅ（１０　ｐｍｏｌ／／￣Ｌ）　ｌ。００　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ（５Ｕ／ｔｔＬ）　Ｏ．１５　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｌ。００　终体积Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　２０．００　１。２。４显影方法　ＰＣＲ产物用１．５％琼脂糖凝胶电泳进行检测；８％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离；用银染法显影。　银染过程：去离子水洗２遍一０．１％银染３０　ｍｉｎ一去离子水洗２遍一氢氧化钠、碳酸钠、甲醛显影一　去离子水洗２遍一１％乙酸终止。再用凝胶成像仪拍照保存。　１。３统计分析　用凝胶成像系统携带的分析软件计算微卫星位点的等位基因的近似大小，统计微卫星位点的等位　基因数、等位基因频率，所得结果用群体遗传学分析软件进行分析、计算多态信息含量（Ｐｍ）和基因杂合　度（Ｈ）。　１．３．１等位基因频率　根据电泳结果判断每一个体的基因型，计算各微卫星位点的等位基因频率，其计算公式为：　维普资讯 http://www.cqvip.com

３期　李红等：伊犁马在四个微卫星位点上的遗传多样性分析　．５７７．　基因型频率：Ｐ　＝（　）／Ⅳ　基因频率：Ｐ　［２（ｉｉ）＋（　１）＋…（Ｌｊ一，。）］／２Ｎ．　其中　为基因型　的频率，Ｐｉ为等位基因ｉ的频率，ｉｉ为纯合子ｉｉ的个体数，｛『ｌ…ｇｎ为杂合子ＬＪ‘‘ｎ　的个体数，　－…　为与ｉ等位基因共显性的第１到ｎ个复等位基因，Ｎ为样本数。　１．３．２多态信息含量（ＰＩＣ）　根据Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等　提出的公式计算多态信息含量（Ｐ０ｌｙ啪ｒ１）ｈｉｃ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ，ＰＩＣ），其公式为：　ＰＩＣ＝１一∑　一∑∑２Ｐ／　．　其中，　为某微卫星位点所具有的等位基因数，Ｐ　、　为某位点第　、．『等位基因的基因频率。　１．３．３基因杂合度（Ｈ）　根据Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等［　］提出的公式计算杂合度（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，Ｈ），其公式为：　Ｈ＝１一　Ｐｉ　其中，　为某微卫星位点所具有的等位基因数，　为某位点第　个等位基因的基因频率。　２结果与分析　２．１基因组ＤＮＡ的检测　从冻血中提取的基因组ＤＮＡ用０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测，用ＥＢ染色观察，将达到ＰＣＲ扩增要　求的基因组ＤＮＡ置一２０℃保存备用。基因组ＤＮＡ的电泳结果。图１　图１基因组ＤＮＡ部分电泳结果　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｐａｒｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＡＧＥ　ｏｆ　ｈｏｒｓｅ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ＤＮＡ　２．２微卫星ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增　微卫星座位ＨＭＳ７的电泳结果。图２　１～ｌ５．伊犁马样　；Ｍ．标准分于量　ｌ—ｌ５．Ｉ１ｉ　ｈｏｒｓｅ　ｓａｍｐｌｅ：Ｍ．１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　图２　ＨＭＳ７座位在伊犁马中部分电泳结果　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｐａｒｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｏｆ　ＨＭＳ７　ｌｏｃｉ　ｉｎ　ｌｌｉ　ｈｏｒｓｅ　２．３各位点等位基因片段大小及频率　列出了四个微卫星位点等位基因的大小及频率。可以看出，被检测的四个微卫星位点在伊犁马群　体中等位基因数为５—７个，其中ＵＣＤＥＱ４４０为７个，ＨＭＳ３为６个，ＨＭＳ７和ＨＭＳ６较少均为５个。表３　维普资讯 http://www.cqvip.com

・５７８・　农业科学　４５卷　表３　四个微卫星位点的等位基因片段大小及频率　Ｔａｂｌｅ　３，Ｉ１ｌｅ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｏｆ４　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　２．４多态信息含量（ＰＩＧ）及基因杂合度（Ｈ）（表４）　表４　四个微卫星位点的多态信息含量及基因杂合度　Ｔａｂｌｅ　４　ｔｈｅ￣ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ　ｏｆ　４　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｉｌｉｅｔ　ｌｏｃｉｓ　３结论与讨论　３．１多态信息含量（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ，ＰＩＣ）是基因丰富度的一个指标。多态信息含量的高　低表明了品种的遗传基础的丰富多样性。Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等ｌ２］首次提出了衡量基因变异程度高低的指标：当　ＰＩＣ＞０．５时，该位点为高度多态位点；当０．５＞ＰＩＣ＞０．２５时，为中度多态位点；当ＰＩＣ＜Ｏ．２５时，为低　度多态位点。此研究中四个微卫星位点的多态信息含量均大于０．５，属高度多态位点。说明该品种在　这四个微卫星位点上具有丰富的遗传基础；该群体在这四个位点上携带有多个不同的等位基因。　３．２基因杂合度（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，Ｈ）又称基因多样度，表示群体在某微卫星位点为杂合子的比例。一个　群体的基因变异，通常可以用多态位点比例和每个位点的平均杂合度来衡量。平均杂合度表示群体在　各微卫星位点平均为杂合子的比例。平均杂合度是衡量群体内遗传变异的有效指标，平均杂合度越大，　群体内的遗传变异程度越大。在研究中四个微卫星位点中，ＵＣＤＥＱ４４０位点的杂合度最高，变异程度最　大；ＨＭＳ７位点的杂合度最低，变异程度最小。李金莲，芒来等ｌ３　Ｊ用１３个微卫星位点检测到蒙古马和纯　血马群体平均杂合度分别为０．４８２　１、０．５４８　７。研究检测结果表明，伊犁马群体平均杂合度为０．７３４　８。　说明伊犁马在ＵＣＤＥＱ４４０位点上的基因变异程度高于在ＨＭＳ７位点上的基因变异程度。　３．３一般来说，杂合度和多态信息含量成正相关；即：等位基因较多，基因型也较多。ＰＩＣ值高，杂合度　大说明群体内基因型一致性差，遗传变异大，选择潜力大，应用于动物遗传育种研究效果就好；反之，ＰＩＣ　值低，杂合度小说明群体内遗传变异小，选择潜力小，应用动物遗传育种效果就差［引。研究结果表明，所　选的四个微卫星位点的平均多态信息含量和平均杂合度分别为０．６９７　３，０．７３４　８；一方面说明伊犁马具　有较高的群体杂合度，品种的整齐度差，可进一步纯繁选育，以提高群体的整齐度和生产性能；另一方面　说明该群体内遗传变异较大，这可能与伊犁马在育种过程中导人外血有密切关系。　总体来说，该品种内具有复杂的遗传背景，遗传变异大，选择潜力也大，今后通过科学的选育，提高　品种品质的可能性也大。　参考文献：　［１］Ｂａｋｅｒ　Ｊ　Ｓ　Ｆ．Ａ　ｇａｏｂ￣ｐｒｏｔｃｏｏｌ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｉｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓ＂ｔａｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ　ｂｒｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｐｗｃ．５ｔｈ　ＷＣＧＡＬＰ，１９９４．２１：５０１—５０８．　［２］Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　Ｄ，＇Ｗｈｉｔｅ　Ｒ　Ｉ　，Ｓｋｄｎｉｃｋ　Ｍ，Ｄａｖｉｓ　Ｒ　Ｗ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｉｎ　Ｉ＇ｌｋａｎ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｏ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ［Ｊ］．　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｎｍｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８０，３２：３１４—３３１．　［３］李金莲，芒来，石＝玎裴．利用徽卫星标记肘蒙占马和纯血马遗传多样性的研究【Ｊ］．畜牧兽医学报，２００５，３６（１），６—９．　［４］刘双，杨焕民，宋屹．利用微卫星标记分析籽鹅的遗传多样分析［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２ＯＯ６，（９）：４５—４６．