水蛭粉中天然水蛭素的测定方法

产品中天然水蛭素的测定方法

（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法） 方法提要（凝血酶滴定法）

水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。

仪器设备

0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；

45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；

pH测试仪；普通玻璃仪器。

试剂

（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）； 0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；

氯化钠；0.9％生理盐水。

溶液的配制

1

1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制

将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。

2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制

用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。

3、凝血酶溶液的配制

用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。

分析步骤

取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。记录消耗凝血酶溶液的体积。

2

结果表述

水蛭素含量按下列公式计算：

C1×V1

样品中水蛭素含量= ————

式中水蛭素含量单位为 ATU/g；

C1----凝血酶溶液的浓度，U/ml；

C2----供试品溶液的浓度，g/ml；

V1----消耗凝血酶溶液的体积，μl；V2----供试验品溶液的加入量，μl； C2×V2

3