第巧卷第２期２００１年３月常熟高专学才 良Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈｕ Ｃｏｌｌｅｇｅｖｏｌ．１５ Ｎｏ． ２Ｍａｒ． ２００１黄酮类化合物清除活性氧自由基性能的研究邹耀洪，，李桂荣“（１．常熟高等专科学校生化系，江苏常熟２１５５００； ２．天津阿尔发保健品公司，天津３００４５１）摘要：以Ｘ － ＸＯＤ体系产生０２ ＇ ， Ｌｕｍｉｎｏｌ作为发光增强剂，采用化学发光法测定了１２种黄酮体清除０２’反应的速率常数ｋ３ ， ｋ３值在１０－５一１。一“（ｍｏｌ／Ｌ）一’．ｓ’之间．以ｋ３值的大小作为指标，对黄酮体的结构与清除。：’活力之间的关系进行了研究，表明４’一ＯＨ和△２（３）双健是清除。：‘的主要活性部位。关键词：黄酮类化合物；活性氧自由基；清除能力；构效关系中图分类号：０６５７．６１文献标识码：Ａ文章编号：１００８一２７９４（２０００）００一００４７一０４黄酮类化合物广泛存在于植物界， 是目前倍受关注的天然活性产物之一。黄酮体抗油脂过氧化活性已经被证实，认为它是作为优良抗氧化剂而起作用〔’〕。近年来对黄酮类化合物的研究逐渐转向其对活性氧自由基的清除及对老年病的防治功效上。黄酮类化合物根据其结构可分成１ ０个类别，如黄酮、黄酮醇、二氢黄酮（醇）、异黄酮、双黄酮、查尔酮、黄烷醇等等［２１。大量研究证明，黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、抗炎症等多种生理活性及药理作用，且无毒，对人类的肿瘤、衰老、心血管疾病的防治有重要意义［３］０在黄酮类化合物清除活性氧自由基能力的研究中， 国内外均采用抑制率【Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｒａｔｅ， Ｉ （ ％ ）〕或半抑制浓度〔Ｈａｌｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＩＣ５０ ］１４］来衡量其清除能力的强弱，但定量比较不易进行。为更好地Ｔ解黄酮体的结构和清除。：’能力之间的关系，本文选取了１２种黄酮体作为清除剂，选用Ｘ一ＸＯＤ一Ｌｕｍｉｎｏｌ的０２’产生模型，采用化学发光法测定了其清除。：’反应的速率常数ｋ３，并对黄酮类化合物的结构与清除。：’活力之间的关系以及清除。：’时的不同作用机制进行了分析和探讨。１实验部分１．１样品和试剂黄酮类化合物试样见表ｔｏ Ｎｏ．ｌ一５从上海东风生化试剂商店购得，Ｎｏ． ６一１２是无锡轻工大学研究所从植物中制备所得。将黄酮体试样溶于３０％的乙醇中，用ＰＢＳ（磷酸盐缓冲液，ｐＨ７．８，余下同）配成１０＇ｓｍｏｌ／Ｌ的待试液，根据清除能力的大小作进一步稀释，使受试浓度落在ＩＣ５０左右的范围内。其它试剂： 黄嚓吟（ｘ）和ｌｕｍｉｎｏｌ （ ３一氨基苯二甲酞阱）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；黄嚷吟氧化酶（ＸＯＤ，活力４０００Ｕ／ｍＬ）和牛血ＳＯＤ（活力５００００Ｕ／ｍＬ）为中科院上海生化所东风生化技术公司出品，ＸＯＤ和ＳＯＤ临用前用适量ＰＢＳ稀释。其它试剂均为ＡＲ级。发光法所用试剂用超纯水配制。 收稿日期：２０００－０３－ １６作者简介： 邹耀洪（１９４８－），男，副教授。常熟高专学报２００１年１．２化学发光法测清除０２’活力１．２．１仪器和测试条件ＳＨＧ一１型生物化学发光仪， 测试时样品室温度３０ ｃＣ，高压５５０伏，甄别电压０．２伏。１．２．２ ０２‘的产生及其抑制Ｘ一ＸＯＤ体系产生。：’， ｌｕｍｉｎｏｌ作为发光增强剂，分别用ＳＯＤ和黄酮体试样清除，用发光仪进行测定。１．３黄酮类化合物清除。：’反应速率常数ｋ３的测定１．３．１测定清除０２’反应速率常数的化学发光法用Ｘ一ＸＯＤ产生。２ ＇ ， ｌｕｍｉｎｏｌ作为发光增强剂，ＳＯＤ作为清除剂，在该体系中，０２‘的反应速率应是：ｄ［ ０２＇ ］／ｄｔ＝Ｅ一ｋ，［ＯＺ＇ ］ ２一ｋ２ ｌ Ｌｕｍｉｎｏｌ ］ ［ ０２ ＇］一ｋ３［ＳＯＤ］［０２＇］（１）因为ＳＯＤ不与ｌ ｕｍｉｎｏｌ反应，并且ＳＯＤ和ｌｕｍｉｎｏｌ的存在不影响。：’的产生速率Ｅ，那么ｋ，，ｋ：和ｋ３分别是。：’消失和与ｌｕｍｉｎｏｌ， ＳＯＤ反应的速率常数。０２’的消失反应是：２０２．二０２＋仇，一［已知ｋ， ＝ １０２ （ｍｏｌ／Ｌ）一ＩＳ－１１０２’＋ｌｕｍｉｎｏｌ一‘、２．．、了，．、八乙八、时了、１ＯＺ’与ｌｕｍｉｎｏｌ的反应是：Ｐ（ｏｘｙｌｕｍｉｎｏｌ ）＋ｂｙ１０ ２・与ＳＯＤ的反应是：０２ ＇ ＋ ＳＯＤ二仇＋０２，一＋ＳＯＤ［已知纯＝ ２ ｘ １０９ （ｍｏｌ／Ｌ）一ＩＳ－ １ ］［５１用仁Ｌ］ ．［ＯＺ＇〕和［ＳＯＤ」代表ｌｕｍｉｎｏｌ １０２’和ＳＯＤ的浓度，当处于稳态时，ｄ［０２． ］／ｄｔ应为０，所以０＝Ｅ一ｋ， 〔０２’］２一ｋ２［Ｌ］〔０２’〕一ｋ３ ［ＳＯＤ ］〔０２． ］Ｅ＝ｋ， ［０２’〕＋ｋ２［Ｌ］［０２’］＋ｋ３ ［ＳＯＤ ］［０２’」‘１了‘‘、了了，、矛矛．、月兮．、Ｊ产０１‘、１１、１了则Ｌｕｍｉｎｏｌ化学发光的定量值城ｑｕａｎｔｕｍ ｙｉｅｌｄ）能被表示为：，＝ｋ ２［Ｌ］［０２’］／Ｅ＝ｋ２［Ｌ］／｛ｋ，［０２’〕＋ｋ２［Ｌ］＋ｋ３ ｌ ＳＯＤ ］｝当［ＳＯＤ］＝０，９＝ＩＮ，则ＩＮ＝ｋ２［Ｌ］／｛ｋ，［ＯＺ’〕＋ｋ２［Ｌ］｝、１口了‘‘、』ｒ、，门矛００、、１１因此，为了定义Ｌｕｍｉｎｏｌ清除仇’的速率常数ｋ２， Ｓｔｅｒｍ一Ｖｏｌｍｅｒ方程［ｓ）可表示如下：ｋ， ｋ，［０２’］＋ｋ２［ Ｌ］＋ｋ３［ＳＯＤ］＝１＋，一下－丁－万，；－－二－，不丁・ＩＳＯＤ１（９）１ａ／１＝ｃｐｏ／ｃｐ＝ｋｉ［仇一」＋ｋ２［ Ｌ１ｋ，［０２’〕＋ｋ２［Ｌ］这里， ｌａ／Ｉ是没有和存在清除剂时。：’的发射强度。上述方程指出，最大发射强度的比率Ｉａ／Ｉ是〔ＳＯＤ］的函数，给出了一个线性关系，其斜率等于ｋ３／ｌｋ，［０２＇ ］＋ｋ２［Ｌ］ｆ ｏ从中可知，一旦ｋ，，ｋ３，［Ｏｚ＇］和［Ｌ］已知时， ｌｕｍｉｎｏｌ与０２’反应的速率常数ｋ：就能得Ｙｌｌ。而当ｋ３／ｉｋ，［０２＇］＋ｋ２仁Ｌ］｝是在二种已知［Ｌ〕值测定时，则ｋ，［０２＇〕项可以删去。在上述体系中，当ＳＯＤ被其他具有类ＳＯＤ活性的清除剂替代时就可以测定各种自由基清除剂对０２’反 应的速率常数ｋ３ ａ当有黄酮体试样存在时， 在二种Ｌｕｍｉｎｏｌ浓度下测定１ａ／Ｉ，可从二条直线斜率Ａ和Ｂ计算其ｋ３值，即ｋ３／１ ｋ，〔０２’〕＋ｋ２［Ｌ］ｉ｝＝Ａｋ３／１ ｋ，［０２’］＋ｋ２［Ｌ］２｝＝Ｂ声口、沪犷吸、、、．．了、．．，了ｎＵ．．．１ｊ．几Ｊ．几所以ｋ３＝ｋ２（［Ｌ］，一〔Ｌ］２）／（贵一合，、、．刀了产‘、，自Ｊ．．二１．３．２ Ｘ１１试体系 ＸＯＤ（用ＰＢＳ适量稀释）１０［ＬＬ， ＳＯＤ（或黄酮体）（用ＰＢＳ适量稀释）１００［．Ｌ， Ｘ一Ｌｕｍｉｎｏｌ混合液（ｐＨ ＝ １０．０４）８９０ ４ｆＬ。反应总体积１０００［．Ｌ，反应ｐＨ＝ １０．０，反应温度２５ ｃＣ。在该反应体系中，各反应物的终浓度分别为：［ｘ］＝１．７８ ｘ １０一’ｍｏｌ／Ｌ， ［ Ｌ］ １＝１．７８ ｘ １０一５ ｍｏｌ／Ｌ，［Ｌ１２＝８．９１ ｘ １０一“ｍｏｌ／Ｌ， ［ＳＯＤ ］＝２．５７５ ｘ １０一‘０ ｍｏｌ／Ｌ，黄酮体试样浓度根据其活力大小调整。第２期邹耀洪，李桂荣：黄酮类化合物清除活性氧自由基性能的研究２结果与讨论２．１ Ｌｕｍｉｎｏｌ与０２’反应速率常数ｋ２经三次重复测定， 得出在该实验条件下Ｌｕｍｉｎｏｌ与仇’反应的速率常数ｋ２＝（１．５８士０．０９） ｘ １护（ｍｏｌ／Ｌ）一’Ｓ－１ ， Ｎｏｂｕｔａｋａ等［６］在相似的反应体系中，ｐＨ ＝７．１时测得的ｋ：为１．５６ ｘ １０６ （ｍｏｌ／Ｌ）一’Ｓ－ ＇， ｐＨ＝ １０．１时ｋ：为１．５１ ｘ １０６ （ｍｏｌ／ Ｌ）一’． Ｓ －＇，与我们数值相吻合，表示测试条件（如ｐＨ，底物浓度和缓冲液离子强度等）对ｌｕｍｉｎｏｌ的ｋ：值影响较小。２．２黄酮类化合物清除０２‘反应速率常数枯在１． ３．２的测试体系中，用黄酮体试样逐个代替ＳＯＤ，在二种ｌｕｍｉｎｏｌ浓度〔Ｌ］；和〔Ｌ］：下测得Ｉｏ／Ｉ，求取每种化合物清除。：’的ｋ３值，并计算ＩＣ５０作为对照分析。每一试验重复测定三次取平均值，结果见表ｔｏ表１黄酮类化合物清除活性氧自由基能力的比较 名称类别纯度ｋ３／ ｘ １０６（ｍｏｌ／Ｌ）一‘Ｓ一‘ＩＣ５ｏ／ｐ．ｍｏｌ ＂ Ｌ一’１．７６１．３４１．９９榭皮素桑色素芦丁黄酮醇 黄酮醇 Ｃ． Ｐ．２．０８２．４０优级纯Ｂ． Ｒ．Ｂ．Ｒ． Ｂ．Ｒ． 黄酮醇氧贰黄酮氧贰 ３．２５０．５２．６４１３５？５黄琴柑橙皮柑双氢黄酮氧贰黄酮氧贰 黄酮氧贰 黄酮碳贰 黄酮碳贰 ０６２．００４．７２５．２２４ ＇，７一二经基黄酮－７－。一半乳糖贰４＇，７一二经基黄酮一７一０一葡萄糖贰４‘一甲氧基一牡荆贰鱿草贰木糖贰１０ＩＩ色谱纯色谱纯色谱纯色谱纯色谱纯０１０３．４１２．１５１．２８１．２６４８６８．５５２．９８３．２１２．８６３．０３异红草贰木杯草素一７一０一葡萄糖贰木杯草素－７－０一半乳糖贰黄酮碳贰 黄酮氧贰 黄酮氧贰 色谱纯色谱纯注： 各黄酮类化合物化学结构式略 黄酮、从表１可见，黄酮醇及其贰等黄酮类化合物清除。：’的ｋ３一般在１０５一１０６ （ｍｏｌ／Ｌ）一‘Ｓ－’之间，与ｌｕｍｉｎｏｌ的ｋ：值相当，比ＳＯＤ的清除速率常数ｋ３［２ ｘ １０９ （ｍｏｌ／ Ｌ）一’．Ｓ－＇］小三个数量级。２．３黄酮类化合物分子结构与清除０２’活力的关系由前人研究的成果， 影响黄酮类化合物抗氧化活性的结构因素主要有：酚经基的取代模式及数目，４＇－经基，经基成贰，经基甲基化和△２（３）双键〔５１。从我们实验结果中可得到以下分析。２．３．１不同类别黄酮体的活性差异比较表１中ｋ ３值可见，黄酮醇和黄酮的清除速率相当，但双氢黄酮则明显降低，橙皮贰的ｋ３比黄酮和黄酮醇小一个数量级，显示了最小的ｋ３１０－１３５ ｘ １０６ （ｍｏｌ／Ｌ）一’．Ｓ－ｉ〕和最大的ＩＣ５０ （６２［ｍｏｌ／Ｌ ）。原因在于△’（，）双键氢化后，缩短了共扼链，改变了黄酮分子的平面结构，因而不利于其抗氧化活性。由此表明，黄酮体母核上△２（３）双键的存在对清除。：’活力的重要性。［７ｌ２．３．２ Ｂ环邻二夯基的重要性榭皮素与桑色素的差别仅在于前者具Ｂ环邻二轻基（ ３ ＇，４‘一二经基），而后者为Ｂ环间二经基（３ ＇，５‘一二经基），榭皮素的ｋ３值显著大于桑色素（１．７６／１．３４）。从Ａｔ草贰木糖贰和４’一甲氧基一牡荆贰的结构可见，Ａ环的取代几乎相同，但前者Ｂ环上有３ ＇，４’一二经基，而后者仅在４‘位上有甲氧基，二者的ｋ３值相差７倍（３．４１／０．４８６），充分显示了Ｂ环邻二经基存在的重要性。２．３．３ Ａ环邻二夯基的作用常熟高专学报２００１年在１ ２种黄酮类化合物中，黄菩贰表现了最大的ｋ３ ［ ５． ６４ ｘ １护（ｍｏｌ／Ｌ）一‘．Ｓ－ｉ〕和最小的ＩＣ５０ （ ０． ５２ｔ．ｍｏ１／Ｌ）。它的Ｂ环无取代，Ａ环上有邻二轻基，说明Ａ环上的邻二经基同样是清除ＯＺ’的活性基团。２．３．４异构破武的空间效应鱿草贰木糖贰是８位碳贰， 而异红草贰是６位碳贰，前者的掩值是后者的１．６倍（３．４１／２．１５），表明糖基取代的位置不同带来了不同的空间效应，影响到黄酮自由基中间体的稳定性，导致其抗氧活性的显著差异。２．３．５ ４’一ＯＨ的主导地位 黄酮环上酚经基的酸性由强到弱的顺序是：７，４’一ＯＨ＞７一ＯＨ或４‘一ＯＨ＞一般酚经基＞５一ＯＨ． ７ －ＯＨ和４‘一ＯＨ的存在对抗氧化性质影响最大。在４’位或７‘位引人轻基，因形成Ｐ一二共扼，延长了黄酮环的共扼体系，促进了电子的离域化，有助于黄酮体在供氢后形成相对稳定的自由基中间体，提高抗氧化能力。从表１可见， 具有游离的４‘一ＯＨ和７一ＯＨ，同时又有Ｂ环邻二经基的黄酮（如鱿草贰木糖贰和异红草贰）及黄酮醇（如懈皮素和芦丁）具有较大的蚝值。７一ＯＨ糖贰化后（如２种木犀草素一７一氧贰）， ｋ３值有所下降。而当４＇－ＯＨ甲基化后，ｋ３值大幅度下降，如４‘一甲氧基一牡荆贰和橙皮贰。值得注意的是， ２种４ ＇，７一二经基黄酮７一氧贰，Ａ环和Ｂ环上均无邻二轻基，同样表现出相当的活力，充分说明了４‘一ＯＨ在清除。：’中的特殊作用，同时也表明３ ＇，４’一二经基的存在虽然是十分重要的，但并不是清除０２’的先决条件。根据本研究的结果， ０２（３）双键和４＇－ＯＨ可认为是黄酮类化合物清除活性氧自由基的关键活性部位。本课题得到无锡轻工大学博士生导师汤坚教授帮助， 谨致衷心感谢。参考文献：［１」邹耀洪，李桂荣．反相高效液相色谱分析杨梅叶中杭氧化成分黄酮类化合物【Ｊ］．分析化学，１９９８，２６（５）：５３１一５３５．［２」肖崇厚．中药化学〔Ｍ〕上海：上海科学技术出版社，１９８７．１９１ － ２５０．［３〕刘诗平．将皮素及其衍生物的生物活性研究〔Ｊ］．中草药，１９９１，２２（４）：１８１一１８４［４］ Ｃｈｅｎ Ｙ ，ｅｔ ａｌ． Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｓ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ［Ｊ］．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １９９０９９：１９一２１．［ ５ ］ Ｎｏｂｕｔａｋａ Ｓｕｚｕｋｉ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｓｕｌｆｕｒ一ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ： ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｂｙ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇｔ ｈｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９２，５６（３） ：４０９一４１１．［ ６ ］ Ｎｏｂｕｔａｋａ Ｓｕｚｕｋｉ， ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｓｐｅｒ－ｏ ｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ［Ｊ］ ． Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９１， ５５（１）：１５７一１６０．［７」邹冲．天然产物杭氧化构效关系及作用机理的研究概况【Ｊ］．天然产物研究，１９９３，５（１）：６６ － ７２．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ ＲａｄｉｃａｌｓＺＯＵ Ｙａｏ－ｈｏｎｇｔ，ＬＩ Ｇｕｉ－ｏｒｎｇ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｙｒ，Ｃｈａｎｇｓｈｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈａｎｇｓｈｕ ２１５５００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｌｐｈａ Ｈｅａｌｔｈｆｕｌ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ （ｋ３） ｏｆ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ０２’ｏｆ １２ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｉｌｕｔｎｉ－ｌｕｍｉｎｏｌ ａｓ ａｐｒｏｍｏｔｅｒ， ｗｈｉｃｈ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ １０一５ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ仇．ａｎｄ ｎｅｓｃｅｎｅ，ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｘ一ＸＯＤ ｗａｓ ａｎａ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ １０一“（ｍｏｌ／Ｌ）一’・Ｓ一’．ｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｏｚ’ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａＴｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅＲｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ４’一ＯＨａｎｄ ，，２０ ） ｄｏｕｂｌｅｂｏｎｄ ｓｅｅｍ ｔｏ ｂｅｔｈｅ ｋｅｙ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ＯＺ’ｌｙｚｅｄ ｔａｋｉｎｇ ｋ３ ａｓ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｉｎｄｅｘｅｄ．ａｄｉｃａｌｓ，ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ， ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙＫｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎｒ
