壳聚糖的抗菌能力研究进展

付俊锋;毛国梁

【摘 要】壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化制得的,特殊的结构使得壳聚糖及其衍生物具有对不同真菌、革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的抗菌能力,因此受到了广泛的关注.总结了近年来对壳聚糖及其衍生物对真菌、革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的抗菌性的研究方面的进展.

【期刊名称】《化工科技》 【年(卷),期】2018(026)004 【总页数】7页(P66-72)

【关键词】壳聚糖;壳聚糖衍生物;抗菌 【作 者】付俊锋;毛国梁

【作者单位】东北石油大学化学化工学院石油与天然气化工省重点实验室,黑龙江大庆163318;东北石油大学化学化工学院石油与天然气化工省重点实验室,黑龙江大庆163318 【正文语种】中 文 【中图分类】O636.1

近年来耐药性和多重耐药性致病菌的逐年增加，使得科研人员更多地将注意力集中在用于抑菌和消毒方面的抑菌材料。壳聚糖(CS)作为一种来源于海洋的高聚物，由于本身具有的抗菌性能受到科研人员的青睐。

壳聚糖由随机重复的D-氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖单元聚合而成，两种单元的比例表现为脱乙酰程度的不同。脱乙酰程度为0状态时即为甲壳素，是自然界仅次于纤维素的天然聚多糖。甲壳素在质量分数为30%～60%的氢氧化钠溶液脱乙酰后形成壳聚糖[1]。大多数的多糖在酸性环境下都是中性或者带有负电荷，而壳聚糖带有正电荷的性质使之相比于其它多糖更具有特殊性[2]。这些性质使得壳聚糖在不同环境下表现出良好的生物相容性，低毒性，低抗敏性及可降解性[3]。除此之外，在研究中发现壳聚糖具有一些其它的生物学特性，比如抗肿瘤作用，抗氧化及抗菌作用[4]。

但壳聚糖中存在较强的氢键，使得仅溶于pH<6的酸性环境中，了壳聚糖在中性和生理环境下的应用。为了解决这一局限性，可以进行壳聚糖修饰改性形成相应的衍生物来，从而改变壳聚糖的水溶性和生物活性。大量文献报道了壳聚糖衍生物的抗菌性及其抗菌机理。作者综述了壳聚糖抗菌方面的研究进展。 1 壳聚糖衍生物的合成

壳聚糖只有在酸性条件下才能溶解的性质了壳聚糖在水相中的应用及表征。而壳聚糖最大的优势就是可以改性成不同的衍生物。壳聚糖具有三个亲核活性官能团：C2-NH3、C3-OH和C6-OH。壳聚糖的化学改性就是通过这三个活性官能团，进行N-改性，O-改性或者N,O-改性。改性后的壳聚糖更好地展现了壳聚糖的生物性质，提高了水溶性，并增强了抗菌性能。

由于水溶性不佳，壳聚糖的改性主要在酸性或非均相环境中进行反应。一种反应方式为一步反应，壳聚糖的三个活性官能团均参与反应，造成产品的异构化并降低了取代度。反应基团的选择取决于所选用试剂的类型。尽管氨基比羟基更容易进行亲核反应，但两种活性基团均可以与酸、烷基卤化物或含硫的异氰化物这样的亲电试剂进行反应，这样的反应可能非选择性地修饰了氨基和羟基。直接对羟基进行修饰可以使用酸性溶剂或使用H2SO4和HMeSO3等做添加剂，通过这种方法可以对

壳聚糖的氨基进行保护，使羟基成为活性组分进行反应。HSO4-或MeSO3-可以保护90%～99%的氨基组分，是简单有效地进行羟基壳聚糖改性的方法[5]。接下来，氨基组分可以通过还原氨化、肽耦合或季胺反应等进行修饰。相反的步骤也可以对壳聚糖进行双改性修饰。

保护基团的引入可以帮助解决之前步骤所产生的问题。在C2-NH3，C3-OH和C6-OH可引入不同的保护基团。常使用邻苯二甲酰基[6]保护壳聚糖的氨基基团，使用三苯基甲基[7]、三甲基硅基[8]、叔丁基二甲基硅基[9]保护壳聚糖的羟基基团。反应结束后再进行脱保护，从而得到不同修饰基团的壳聚糖衍生物。虽然引入保护基团增加了改性的反应步骤，但使用保护基团改性可以在不影响壳聚糖相对分子质量的情况下进行大量的改性，不仅可以得到N-壳聚糖或O-壳聚糖，也可以增加步骤生成N,O-壳聚糖。 2 壳聚糖的抗菌机理

由于影响壳聚糖生物性能的因素比较多，所以很难去考察壳聚糖抗菌的真正机理。利用壳聚糖与细菌表面的静电相互作用，使得壳聚糖可以更好的附着在细菌的表面[10]。一般来说，细菌因透化作用使细菌内部物质渗出而死亡[11]。研究表明，壳聚糖可以渗入到细胞内部通过结合核酸信息，影响细胞的DNA表达[12]。但壳聚糖引起这种细胞内特定的反应时，需要先透过细胞的等离子体膜，使得这种抗菌机理高度依靠微生物的类型和壳聚糖的相对分子质量。 2.1 壳聚糖及其衍生物对革兰氏阳性菌的抗菌机理

壳聚糖及其衍生物对革兰氏阳性菌抗菌机理的示意图见图1。 图1 壳聚糖对革兰氏阳性菌的抗菌机理

在革兰氏阳性菌中，细胞壁是由一层肽聚糖构成，这种肽聚糖层是带有负电荷的磷壁酸和乙酰胞壁酸形成的。磷壁酸可以为细胞壁提高强度，并在细胞壁中均匀排布高密度电荷，从而影响离子在外表面的通道层。在pH<6的情况下，壳聚糖中的

氨基组分所带有的正电荷可以与Ca2+或Ag+这样的金属离子相比较。因此，壳聚糖骨架中的阳离子电荷对抗菌活性有着重要的作用。壳聚糖可以与革兰氏阳性菌肽聚糖层中的磷壁酸进行非共价键的结合[11]。细胞壁中的肽聚糖被水解，导致细胞内成分的泄漏，有研究证实了来自细菌细胞电解质和蛋白物质的泄漏[13]。在对突变的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的检测中，没有基因影响了磷壁酸的生物合成，这也证明了磷壁酸对壳聚糖抗菌活性的重要性。同时抑制突变的S.aureus要优于抑制野生的S.aureus，也证明了聚阴离子的磷壁酸提高了壳聚糖对阳性菌的抗菌作用[11]。壳聚糖与磷壁酸的静电相互作用破坏了磷壁酸的功能，造成了细菌的功能性紊乱。其它阳离子杀菌剂也显示出了基于阴离子磷壁酸对于革兰氏阳性菌的活性[14]。表明壳聚糖对于革兰氏阳性菌的作用方式是通过静电作用与磷壁酸相结合，从而破坏细菌的不同功能导致革兰氏阳性菌死亡。 2.2 壳聚糖及其衍生物对革兰氏阴性菌的抗菌机理

壳聚糖及其衍生物对革兰氏阴性菌抗菌机理的示意图见图2。在革兰氏阴性菌中，胞质膜上的一层薄肽聚糖层被额外的一层外膜覆盖。外膜的主要成分是脂蛋白和脂多糖，在脂蛋白和脂多糖中出现的亲水性特征侧链有助于识别革兰氏阴性菌。为了与革兰氏阴性菌相互作用，克服外膜的保护是十分必要的。一种观点认为当pH>pKa时，一种螯合作用的影响会高于静电作用的影响[15]，使得壳聚糖破坏了细胞壁的完整并与金属离子产生螯合作用，影响细菌重要营养物质的摄入[16]。另一种观点则是认为壳聚糖与外膜中具有阴离子的脂多糖发生静电作用[17]。这两种机理的主导性还尚不能确定。也有研究表明壳聚糖影响了内膜，从而导致了细菌内物质的流出[18]。此外，通过观察发现壳聚糖可以透过阴性菌的细胞膜，这就可能使得壳聚糖可以与DNA或RNA相结合，引发细菌内的应答[18]。 图2 壳聚糖对革兰氏阴性菌的抗菌机理 2.3 壳聚糖及其衍生物对真菌的抗菌机理

壳聚糖及其衍生物对真菌抗菌机理的示意图见图3。 图3 壳聚糖对真菌的抗菌机理

壳聚糖与真菌的作用一般都是利用壳聚糖的正电荷与真菌细胞膜表面的负电荷发生作用渗透至真菌内进行反应，从而影响核酸的合成并抑制蛋白的合成[19]。对真菌细胞膜组成的磷脂脂肪酸的研究表明，细胞膜上不饱和脂肪酸的组成增加了壳聚糖对细胞膜的活性。在使用壳聚糖抑制真菌的实验中，减少真菌的不饱和脂肪酸的含量，使得壳聚糖对真菌抗菌性能较之前有着大幅度的降低[20]。这表明壳聚糖抗真菌能力取决于在不同真菌的细胞膜上流动性的差异。科研人员证实了对真菌中三磷酸腺苷对于壳聚糖的摄取具有直接关系，可以在4 ℃或在叠氮化物存在下证实[21-22]。这两种方法同时抑制了三磷酸腺苷的产生，且都不能使壳聚糖透过等离子体膜。在室温下或没有叠氮化物的存在下，30 min内就可以看到壳聚糖的吸收，这表明壳聚糖的吸收不仅与扩散有关，也高度依赖三磷酸腺苷。壳聚糖进入真菌内部，可以影响核酸信息和蛋白的合成[23]。

总而言之，壳聚糖与细菌及真菌阴离子表面的静电相互作用是决定壳聚糖抗细菌及真菌机理的关键。这也解释了为什么带有永久性正电荷的季铵盐改性的壳聚糖衍生物通常比壳聚糖本身具有更好的抗菌能力[24]。虽然静电相互作用非常的重要，但壳聚糖也可以以非共价键的形式与胆固醇相结合[25]，这也表明其它非共价键的相互作用可以与静电相互作用同时作为壳聚糖抗菌能力的机理来体现。 3 壳聚糖及其衍生物的抗菌性能

3.1 壳聚糖及其衍生物对革兰氏阳性菌的抗菌性能研究

在抑制革兰氏阳性菌的研究中，研究人员发现脱乙酰程度增加，最小抑菌浓度(MIC)随之降低，这与之前讨论的针对革兰氏阳性菌的抗菌原理是一致的。此外，相对分子质量(Mr)也是一个重要的因素。No等使用壳寡糖、低Mr壳聚糖和高Mr壳聚糖用于抑制革兰氏阳性菌时，发现壳寡糖的效果要明显低于后两种壳聚糖

[26]。结果说明长链的壳聚糖更优于短链的壳寡糖，证明了之前表述的抗菌原理，并解释了静电相互作用在抑制革兰氏阳性菌时起到重要的作用。而且随着Mr的增加，抗菌效果也随之增加[27]。壳聚糖Mr和脱乙酰程度对三种蜡样芽孢杆菌(B.cereus)生长的影响显示，在较高的脱乙酰程度条件下具有更佳的抗菌活性[28]。脱乙酰程度的影响与壳聚糖和革兰氏阳性菌之间的静电相互作用有关，因此如果脱乙酰程度增加，抗菌活性就会增加[29]。壳聚糖在不同的脱乙酰程度条件下抑制S.aureus，实验结果表明，脱乙酰化程度越高，对细菌的抗菌作用越大[30]。即脱乙酰程度增加，就有更多带有正电荷的自由氨基基团暴露在外，从而增加壳聚糖的正电荷[31-32]。

尽管壳聚糖本身具有抗真菌的能力，但对于现有的商业杀菌剂的效果还是要低的多，所以就要对壳聚糖进行改性为壳聚糖衍生物。研究人员用不同的酰基硫脲壳聚糖衍生物抑制S.aureus和Sarcina sp，抗菌能力提升了两倍甚至更多[33]。胸腺嘧啶壳聚糖[34]，磺化壳聚糖[35]和烷基磺化壳聚糖[36]和增强了抗S.aureus的抗菌能力。交联壳聚糖水凝胶可以增强抗菌活性[37]，交联对苯二甲酰硫脲壳聚糖和羧甲基对苯二甲酰硫脲壳聚糖增强了S.aureus的抗菌活性[38-39]。季铵盐壳聚糖具有较高的抗菌活性和良好的水溶性。比如，甲基-N-(4-甲基吡啶)壳聚糖氯化物[40]、甲基-N-(4-N,N-二甲基肉桂氨基)壳聚糖氯化物、N,N,N-三甲基壳聚糖氯化物和N-羟丙基-N,N-二甲基壳聚糖衍生物[41]具有良好的抗S.aureus的活性。抗菌能力的增强是基于壳聚糖衍生物中增加了永久的正电荷所增强的静电相互作用。 3.2 壳聚糖及其衍生物对革兰氏阴性菌的抗菌性能研究

壳聚糖不仅仅可以抑制革兰氏阳性菌，也可以抑制革兰氏阴性菌。与革兰氏阳性菌类似，相同的Mr时MIC随着脱乙酰程度的增长而增长。相同脱乙酰程度时，Mr高的壳聚糖MIC更高。这两个影响可以证实之前的抗菌机理。同时，壳聚糖的来源不会影响壳聚糖的抗菌能力，如果纯度和特性类似的不同来源壳聚糖作用方式不

会有所改变。例如真菌提取的壳聚糖和虾蟹提取的壳聚糖在抑制四种不同的革兰氏阴性菌时具有相似的MIC值[42]。

与革兰氏阳性菌类似，Mr的影响基于革兰氏阴性菌细菌的种类。高Mr的壳聚糖要比低Mr的壳聚糖显示出更好的抗菌活性[26]。还有研究结果显示，随着壳聚糖的Mr增加，抗菌活性随之增加[27]。根据这些研究，细胞膜的破裂和渗透是主要的抗菌机理。在壳聚糖和细菌细胞表面之间，主要的作用方式与静电相互作用有关。对于脱乙酰程度来说就更加直接，如果脱乙酰程度增加，抗菌活性就会增加[29]。壳聚糖在不同的脱乙酰程度条件下可以有效地抑制革兰氏阴性菌，同时脱乙酰程度的增大也增强了抗菌活性[30]。降低pH值也可以增强壳聚糖抗革兰氏阴性菌的能力[31]，这样的情况也与之前描述的革兰氏阳性菌类似。

文献中报道了不同的壳聚糖衍生物对革兰氏阴性菌抗菌性能的研究。酰基硫脲壳聚糖衍生物[33]，不同的N-苄基壳聚糖衍生物[43]，胸腺嘧啶壳聚糖[34]，磺化壳聚糖[35]，以及烷基磺化壳聚糖[36]可以增强抗革兰氏阴性菌的活性。交联壳聚糖水凝胶可以增强大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的抗菌活性[37]，交联对苯二甲酰硫脲壳聚糖[38]和交联对苯二甲酰硫脲羧甲基壳聚糖[39]可以提升抗E.coli的能力。有很多关于壳聚糖衍生物的例子以及不同的制备方法，但是影响壳聚糖衍生物抗菌性能的重要因素依旧是Mr和脱乙酰程度。Meng等的一项重要研究将Mr不同的三种氨乙基壳聚糖和氨乙基壳寡糖抑制E.coli，结果显示氨乙基壳寡糖的MIC远高于氨乙基壳聚糖，这与之前讨论的结论有所区别[44]。另一种是具有极好抗菌活性及水溶性的季铵盐壳聚糖。例如，N-甲基壳聚糖衍生物，N-(4-甲基吡啶)壳聚糖氯化物，N-(4-N,N-二甲基氨基肉桂酰)壳聚糖氯化物和N,N,N-三甲基壳聚糖氯化物可以抑制革兰氏阴性菌的生长[41]。同时，双改性缩氨基硫脲壳聚糖[45]和羟基苯基苯磺酰胺壳聚糖[46]也可以抑制E.coli和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的生长。2-羟丙基二甲基苄基铵 N,O-(2-羧乙基)壳聚糖氯

化物在不同脱乙酰程度下可以显现出良好的抗E.coli的抗菌活性，同时随着季铵化的程度增长而加强[47]。N,O-氨基肉桂醛壳聚糖具有比壳聚糖更好的抗菌性能[48]。2-羧丙基二甲基苄基铵N,O-羧甲基壳聚糖氯化物也可以得到同样的结论[48]。 3.3 壳聚糖及其衍生物对真菌的抗菌性能研究

有研究人员使用壳聚糖在不同Mr的情况下测试了三种真菌的抑菌性能，Mr为41.2 kDa的壳聚糖具有更好的效果，同时发现低Mr的壳聚糖相对于高Mr的壳聚糖具有更好的效果[49]。结果表明壳聚糖对真菌很大程度取决于不同的Mr，低Mr的壳聚糖似乎对菌丝生长更有效果。对比已知的抑菌原理，一定的链长度是干扰真菌细胞膜的必要条件。对壳寡糖所观察到的效果可能与细胞内的反应有关，从而起到了对真菌的抑制作用。Rahman等的研究中，具有15～40个单元的壳寡糖体现出对于两种葡萄孢菌良好的抑制作用，抗菌活性随着Mr的增加而降低。相比于Mr，壳聚糖的脱乙酰程度也是壳聚糖抗真菌的一个重要的因素。不同的研究表明增加脱乙酰程度可以增加壳聚糖的抗真菌能力。通常，脱乙酰程度增加而Mr降低，壳聚糖的抗真菌能力也随之增加，在不同的Mr和脱乙酰程度的壳聚糖测试抑制四种不同的真菌时可以证明这个结论，这些结果也可以解释壳聚糖抗菌机理。壳聚糖和带有聚阴离子的磷脂层之间的静电相互作用是壳聚糖抗真菌作用方式的重要机理。增加脱乙酰程度可以暴露更多的带有正电荷氨基基团，使得有更多的正电荷聚集在聚合物上，从而增强静电相互作用。

异环或芳香族等取代基的引入可以增加抗真菌活性，就连脂肪族的侧链也被证明可以增加壳聚糖的抗菌活性。例如，采用还原胺法制备的不同的N-苄基壳聚糖衍生物，可在一般情况下增加抗真菌的活性。在脂肪族的N-取代壳聚糖衍生物和N-苄基壳聚糖衍生物也可以得到类似的结论。此外，基于胸腺嘧啶的壳聚糖衍生物比胸腺嘧啶本身具有更好的抗真菌的能力[34]。其它不同杂环的N-取代壳聚糖衍生物，不同的亚氨基壳聚糖衍生物，烷基磺化壳聚糖可以增强壳聚糖的抗真菌能力[36]。

4 结束语

壳聚糖因其可以在不同领域的广阔应用而受到科研人员的青睐，其中最具潜力的是壳聚糖及其衍生物具有的抗菌性能。壳聚糖及其衍生物的抗菌作用可以作用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，而且抗菌能力的强弱可以由其脱乙酰程度、Mr、衍生化手段及制备方法所决定。相比于壳聚糖本身，引入壳聚糖衍生物可以提高壳聚糖的抗菌性能，并且可以改善壳聚糖较差的水溶性，可以在中性环境下应用抗菌性能。在考察壳聚糖衍生物时，相应活性基团的取代度和取代方式是影响壳聚糖衍生物抗菌能力强弱的重要因素。

尽管现在有越来越多的关于壳聚糖及其衍生物抗菌的文章，但依旧存在许多问题。还需要有更进一步的研究来证实壳聚糖的抗菌机理。而在此之前，在研究壳聚糖的抗菌作用时，壳聚糖的相对分子质量、脱乙酰程度、pH值等因素扮演着至关重要的作用，应在考察壳聚糖及其衍生物的抗菌作用时加以区分。 参 考 文 献：

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