水处理微生物实验二报告

一、血球计数板的使用及酵母菌的显微计数（暗视野）

（一） 实验目的 学习血球计数板的使用。

直接计数法测定样品中酵母细胞数。

（二）实验原理

利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。

血球计数器是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16个中方格，每中方格又分成25个小方格（麦氏血细胞计数板）。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方格又分成16个小方格（希里格血细胞计数板。但是不论哪一种，一个大方格，都等分成（25×16或16×25）400个小方格。（图2－1）因为每个大方格边长为1毫米，载片与盖片间距离为0.1毫米，所以每个计数室（1个大方格）体积为0.1立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1毫升菌液内所含的菌数。

（三）实验材料

1. 器材

血球计数板、显微镜。 2. 菌种 酿酒酵母菌液。

（四）操作步骤 1. 血球计数板的操作

1） 取一个清洁的血球计数板，将洁净的专用盖玻片放置在计数室上；

2） 把在液体培养基上室温培养了24～48h的酿酒酵母菌悬液进行稀释，以每小格有

3～5个酵母菌为宜；

3） 摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，沿盖玻片的边缘滴一小滴（不宜

太多），使菌液自行渗入计数室（两个计数室各滴一滴；注意：加菌液时不得使计数室内有气泡），静置5 min；

4） 将计数板放置在显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到方格网，然后转到高倍镜下

进行观察和计数。 2. 计数方法

1） 不同规格的计数板的计数方法略有差异，一个大方格是16个中方格的（16×25），

应当数4角4个中方格（即100个小方格）的菌数；一个大方格是25个中方格的（25×16），除取4角4个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的菌数。注意：酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即可作为两个菌体计数；位于两个中方格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数，即数上不数下，数左不数右；

2） 每个样品重复计数2～3次（每次计数结果不应相差太大，否则重新操作），求平

均值；

3） 按下列公式计算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数； 16×25计数板：

总菌数/ml100个小方格内菌数40010000稀释倍数100

＝每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数

25×16计数板：

总菌数/ml80个小方格内菌数40010000稀释倍数80

＝每小方格内菌数×4×106×稀释倍数

（五）实验报告内容

记录计数结果并计算出每毫升菌液中的酵母菌细胞数。

（六）思考题

1. 在滴加菌液时，为什么要先盖上盖玻片后再滴加菌液？能否先滴加菌液再盖盖玻片？ 2. 用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？ 3. 计数细菌数目时此法是否适用？

实验三 细菌的革兰氏染色

（一）目的要求

学习并初步掌握革兰氏染色法。

了解革兰染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 （二）基本原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christsin Gram氏创立，而后一些学者在此基础上作了些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

（三）实验材料

1．菌种：大肠杆菌的斜面培养物。 2．染色剂：革兰氏染色液。

3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。

（四）实验步骤 1．制片

取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。 （1） 涂片

取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，分别从以上菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上（图1－2）。

载玻片要洁净无迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 （2） 干燥

室温自然干燥或烘干。 （3） 固定

涂面朝上，通过火焰2～3次。

此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。

要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2．初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2 min,水洗。 3．媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 4．脱色

用吸水纸吸去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 5．复染

用蕃红液复染约2 min，水洗。 6．镜检

干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。

图片说明：1.取接种环；2.将接种环放在酒精灯上灼烧；3.摇匀菌液；4.灼烧试管口；5a5b.取菌液或从斜面上取菌苔；6取菌完毕，再烧试管口，塞上棉塞；7a7b.涂片，从斜面上取的菌与载玻片的水滴混匀后涂片；8.涂片完毕，灼烧接种环；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干

（五）实验报告内容

根据观察结果，绘出细菌的形态图。

（六）思考题

1. 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？