广西农业科学２０１０，４１（８）：８２２—８２３ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 酿酒微生物计数方法探讨 景晓卫，唐玉明，任道群，姚万春 （四川省农业科学院水稻高粱研究所，四川泸州６４６１００） 摘要：采用琼脂倾注法接种不同菌株，并对平板菌落分别进行人工计数与自动计数，对两种方法的计数结果进行 比较分析，以验证全自动菌落计数仪的菌落识别功能和计数准确性。结果表明，全自动菌落计数仪对于菌落较小的细 菌类能准确地快速计数，重现性好，最大误差率为３．９５％；但对于菌落形态较大的霉菌类、酵母类等计数准确率低，最 大误差率分别为４２．８６％和３５．５０％。因此，在实际应用中应以自动计数为主，通过合理设置菌落直径、颜色、亮度、背景 偏差等参数以方便自动计数，同时采用人工计数对结果进行修正，以提高计数准确率。 关键词：微生物；平板菌落计数；人工计数；自动计数 中图分类号：ＴＳ２６１．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—８１６１（２０１０）０８—０８２２—０２ １Ｊ一 ■，ｉＳＣＵＳＳｌＯｎ ｏｎ Ｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎ￣ｍｅｔｌｌｏｄ ｏｌ ｗｉｎｅ－ｍａＫｌｎ￣ｍｉｃｒｏ ● ・■ ・● －１ １ ｎ ■ ■ ● ● ＇ｂｅｓ ＪＩＮＧ Ｘｉａｏ—ｗｅｉ，ＴＡＮＧ Ｙｕ—ｍｉｎｇ，ＲＥＮ Ｄａｏ－ｑｕｎ，ＹＡＯ Ｗａｎ－ｃｈｕｎ （Ｒｉｃｅ ａｎｄ Ｓｏｒｇｈｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｕｚｈｏｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ ６４６１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｕｎｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｅｒ，ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａｎｄ ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｗａｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｑｕｉｃｋ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌｅｒ ｃｏｌｏｎｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ３．９５％，ｗｈｉｌｅ ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｌｏｗ ａｃｃｕｒａｃｙ ｆｏｒ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｉｇｇｅｒ ｃｏｌｏｎｉｅｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ｙｅａｓｔｓ ａｎｄ ｍｏｕｌｄｓ，ｉｎ ｓｕｃｈ ａ ｃａｓｅ ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ４２．８６ ａｎｄ ３５．５％ｍａｘｉｍｕｍ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ ｗａｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｕｌｄ ａ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｔｔｉｎｇ ｕｐ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅａｓｏｎａｂｌｙ，ｓｕｃｈ ａｓ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ｃｏｌｏｒ，ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ａｎｄ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｏｄｉｉｅｄ ｔｆｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｔｓ ａｃｃｕｒａｃｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏｂｅ；ｐｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ；ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ；ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｏｕｎｔｉｎｇ 白酒酿造过程实际上是微生物富集、代谢的过 程，因此，要提高白酒的优质品率，必须从微生物开 始进行研究．而微生物计数一直是酿酒微生物研究 中一个重要基础指标…。酿酒微生物计数主要采用 平板菌落计数法，因平板菌落计数法通常做梯度稀 释．所以计数的线性范围大。重复性、平行性好。是 一中选育的酵母Ｓ２．１０、霉菌Ｃ一２４，以及１０种不同配方 的人工窖泥中的细菌。培养基配方采用牛肉膏蛋白 胨培养基、ＰＤＡ培养基。试验仪器为全自动菌落分 析仪。 １．２试验方法 １．２．１菌落识别试验将巨大芽孢杆菌１．２２３、酵 种经典的计数方法。目前，平板菌落计数主要靠 母Ｓ２．１０和霉菌Ｃ一２４分别用无菌水制成含菌量适宜 的菌悬液，并采用琼脂倾注法接种，倒置于３２℃培 养箱中培养４８ ｈ，然后对各平板菌落分别进行人工 计数和自动计数。统计两种计数结果的误差【２］。 １．２．２计数重现性试验将巨大芽孢杆菌１．２２３ 人工主观识别和判断来进行，由于人工计数易受主 观影响，工作量大、重现性差、效率低，因此亟待改 进。本文将全自动菌落分析仪的菌落计数结果与人 工计数结果进行比较．以验证其菌落识别功能和计 数准确性，为实际应用全自动菌落分析仪提供指导。 用无菌水制成含菌量适宜的菌悬液，采用琼脂倾注 法接种，倒置于３２℃培养箱中培养４８ ｈ，由４人分别 对同一平板进行人工计数，同时自动菌落计数仪设 置相同参数对同一平板计数４次，统计两种计数结 果的误差［ 。 １材料与方法 １．１供试材料 供试菌株分别为巨大芽孢杆菌１．２２３。从曲药 收稿日期：２０１０—０５—０６ 基金项目：四川省财政育种工程青年基金项目（２００９） 作者简介：景晓卫（１９８４一），女，四川通江人，研究实习员，主要从事酿酒微生物菌种选育及酿酒工艺研究工作。 景晓卫等：酿酒微生物计数方法探讨 ・８２３・ １．２．３计数准确性试验每隔１５ ｄ对实验室培养 表１ 不同微生物菌落不同计数方法计数结果 的ｌ０种不同配方的人工窖泥进行１次微生物计数， Ｔａｂｌｅ １ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ’Ｓ ｃｏｌｏｎｙ ｎｕｍｂｅｒ ｃｏｕｎｔｅｄ ｂｖ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ 连续进行６个月，每次对好氧细菌、好氧芽孢杆菌、 厌氧细菌、厌氧芽孢杆菌计数．获得大量数据后进 菌种 样本号不 总 ｃ个 绝 善值误差率 （％） 行分析，验证全自动菌落计数仪的计数准确性。试 Ｓｔｒａｉｎ Ｓａｍｐｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ＵＩ）№ ｄｉＡＩｆｆ１ｓ。ｅｒｅｎｃｅ Ｅｒ１ｕｔｅ ｒ０ ｔ。 验方法：无菌操作称取１０ ｇ土样加至１００ ｍＬ无菌水 １６９ １６９ 中，混匀：吸取５ ｍＬ土壤悬液加入到４５ ｍＬ无菌水 细菌１．２２３ １９１ １９０ Ｂａｃｔｅｒｉａ 中，此为稀释１０倍；吸取１ ｍＬ土壤悬液加入到９ ｍＬ １０３ １０６ １．２２３ ８２ ８２ 无菌水中。制成１０也稀释液，依次类推，经系列稀释 ｌ７７ ｌ７０ ２１ １２ 成１０。、１０ 、１０ 、１Ｏ 层级；分别从上述梯度菌液中吸 霉菌Ｃ一２４ １７ １１ 取１ ｍＬ置于培养皿。用琼脂倾注法接种，倒置于 Ｍｏｕｌｄ １５ １７ Ｃ一２４ １４ ｌ０ ３２ｃＣ培养箱中培养７２ ｈ；选择适宜梯度对同一平板 ８ ７ 上的菌落分别进行人工计数和自动计数，统计两种 ３ｌ ２Ｏ 计数结果的误差。 酵母ｓ２．１Ｏ ２５ １７ ２４ ２１ Ｙｅａｓｔ Ｓ２．１Ｏ １８ １５ ２结果与分析 ２４ １８ ２．１不同菌落识别 表２ 同一平板不同计数方法多次重复计数结果 从表１可以看出，对于细菌。人工计数结果与自 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ’Ｓ ｃｏｌｏｎｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｎ 动计数结果误差较小，最大误差率为３．９５％：但对于 ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ 霉菌和酵母。人工计数结果与自动计数结果误差较 不同人计数菌落数（个） 不同次数自动计数菌落数（个） 编号 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｅｄ ｂｙ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｅｄ 大，最大误差率分别为４２．８６％和３５．５０％，原因可能 Ｎｏ．ｍａｎｕａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ４ ｍａｎ—ｔｉｍｅｓ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｆｏｒ ４ ｔｉｍｅｓ 是酵母和霉菌菌落较大，如果数量较多，菌落容易 １ １８１ ｌ ３ ｌ ７２ ｌ７６ ｌ，９ ｌ ７ ｌ７９ ｌ，９ 发生交叠，导致全自动菌落计数仪不能准确计数。 ２ ８６ ８ｌ ８２ ８５ ８６ ８６ ８６ ８６ ２．２计数重现性试验 ！ 箜 从表２可以看出．对于同一平板。不同的人因为 ２．３计数准确性结果 主观识别经验不同而导致计数结果有差异：而全 为了比较人工计数和自动计数结果的差异显 自动菌落计数仪只要参数设置不变．则计数结果一 著性，将所得大量原始数据进行Ｔ检验，结果如表３。 致，说明全自动菌落计数仪的重现性好。 表３结果显示，人工计数与自动计数结果无显著差 异，误差率低于１０．Ｏ％。 表３人工计数与自动计数Ｔ检验分析结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｔ－ｔｅｓｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ∞ 叭∞ ～ｎ ｎ 一 舶 ∞ ａｒｔｉｆｉｎ ｃｉａｌ ａｎｄ ａｕｔ～ 一 ｍ 加ｍ ｏｍａｔｉｃ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ３结论与讨论 落。因此，在实际应用中应以自动计数为主，通过合 理设置菌落直径、颜色、亮度、背景偏差等参数，方 全自动菌落计数系统将现代计算机技术成功 便实现统计；同时。针对全自动菌落计数仪不能准 地应用到微生物计数方面，从而使微生物的计数工 确识别的情况．用人工计数对结果进行修正，以提 作由沿用百年的人工操作走向自动化，极大地提高 了Ｔ作效率，其优点显而易见。但全自动菌落计数 高计数准确率。 仪在应用时存在一些局限性，如对于细菌类全自动 参考文献： 菌落计数仪能较准确地快速计数，但对于菌落形态 ［１］傅金泉．中国酿酒微生物研究与应用［Ｍ］．北京：中国轻 工业出版社，２００８． 较大的微生物，如酵母、霉菌等的识别率较差：培养 ［２］赵斌，何绍江．微生物学实验［Ｍ］．北京：科学出版社， 基成分不纯净或样品中带有杂质、气泡等，会增加 ２００２． 菌落计数的难度；采用琼脂倾注法接种，部分菌落 ［３］杨玉琴，姚楚水，古希波．平板菌落自动识别计数方法 因生长在培养基深层而被仪器遗漏无法计数：菌落 的研究［Ｊ］．中国消毒学杂志，２００１，１８（３）：１４１—１４４． 形状不规则计数仪不能识别或易被识别为多个菌 （责任编辑麻小燕）