第4O卷第5期 2 0 1 3年9月 酿 酒 Vo1.40.№.5 Sep.,2013 LIQUOR MAKING 文章编号:1002—8110(2013)05—0033—08 有益功能微生物在酿酒生产中的研究及应用 周新虎,陈 翔,李 浩,甘广东,张龙云,姜 雷 (江苏洋河酒厂股份有限公司,江苏宿迁223800) 摘要:将传统酿酒工艺和现代生物工程技术相结合,筛选和选育酿酒有益功能微生物,通过强化大曲、人工老 窖、功能性茵液、多微功能曲等方式应用到酿酒生产中,可有效提高白酒的品质。 关键词:功能微生物;强化大曲;芽孢杆菌;调味酒;有机酸 中图分类号:TS262.3;TS261.1;TS261.4 文献标识码:B The Research and Application of Beneficial Microorganisms in the Production of Liquor ZHOU Xin-hu,CHEN Xiang,LI Hao,GAN Guang-dong,ZHANG Long-yun,JIANG Lei (Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China) Abstract:The Modem biotechnology and traditional brewing technology were combined in this research.Many microorganisms which were beneficial to the production of liquor were screened and breeded.And it was used to the production of liquor by Fortiifed Daqu,Artificial old eeNar,Functional broth and Mu1tiple—micmbe8 functional bran starter.The quality of Liquor was effectively improved. Key words:Functional microorganisms;Fortiifed Daqu;Bacillus;Flavoring liquor;Organic acids 微生物在白酒的酿造过程中起着极其重要的 的优势微生物进行分离、纯化、筛选和鉴定,共分离 作用,从大曲的生产到窖池发酵,微生物都参与其 霉菌8株,细菌5株,酵母菌6株(表1 o根据菌落 中,并发挥着不可替代的作用,可以说是微生物“酿 特征和菌体形态参照《真菌鉴定手册》、《常见与常用 造”了白酒。但是,由于地域、环境、季节和生产工艺 的不同,以及参与酿造的微生物的种类和数量的不 同,代谢产物也会存在差异,直接影响白酒的产量 和质量。 真菌》、《微生物分类学》等方法进行鉴定[】-3]。 随着现代生物工程技术的发展,酿酒有益微生 物不断被发现,以不同形式应用到酿酒生产实践 中。近些年,我们从洋河大曲及洋河酿酒环境中筛 选到数十株有益功能微生物,分别具有某种特殊的 1.2产香微生物的筛选 代谢能力,具体应用这些微生物和酿酒生产工艺相 结合,我们做了一些研究和探索。 1 强化大曲的研制和应用 1.1 大曲中微生物的分离和鉴定 采取和自然发酵条件近似的小麦固体培养基和 麸皮固体培养基方法对产香微生物进行了初筛,使 用感官评定的方法进行判断,重点放在筛选能产酯 香的酵母和能产生焦香的细菌。 利用多种培养基对大曲发酵和贮存各个时期 收稿日期:2013—07—10 结果发现J-9和J一10两株酵母菌产酯香明显 强于其它菌株,)(J—l和XJ_3两株芽孢杆菌焦香明 显强于其它菌株。利用分子手段测定J-9、J一10、 XJ一1、XJ一3的基因序列,将测序结果提交到 NCBI—BLAST上进行比对。结合生理生化鉴定结果, 作者简介:周新虎(1962一),男,江苏宿迁人,硕士,高级工程师,江苏洋河酒 厂股份有限公司副总裁、总工程师,首届中国白酒科学技术大会优秀件技专 家,中国食品工业协会白酒委员会专家,中国酒业协会白酒技术委员会委 员,是中国绵柔型白酒始创者之一。 第五期 周新虎,等:有益功能微生物在酿酒生产中的研究及应用 2013 菌、醋酸菌、放线菌、乳酸菌、酵母菌、甲烷菌、硫酸 分类计数,结果见表3;对新老窖池中窖泥成分进行 化验,结果见表4。 表3不同窖龄窖泥中微生物数量 10 个/g 盐还原菌和硝酸盐还原菌等多菌种的复合菌群,它 们之间互利共生代谢产生了浓香型白酒中的各种 香味成分[41。窖泥中各菌种是互利共生的关系,通过 菌群的协同作用,在酒醅形成“多微共酵生态体 系”,对浓香型白酒香味成分的形成及其量比关系 的协调起着至关重要的作用。 2.1 不同窖龄窖泥中的微生物及理化分析 取洋河酒厂不同种类型的窖泥进行细菌分离, 表4老窖新窖的水分及营养成分分析 注:多点取样的混合样品 老窖和新窖的窖泥微生物数量和种类有明显差 异,老窖各类微生物总数明显多于新窖,厌氧细菌 通过对老窖泥理化成分及微生物的研究,应用 经筛选、选育及驯化出的复合功能菌为主要菌种, 根据老窖泥中的物质成分选择适宜的天然有机物料 并进行合理配置,从水分、温度、pH等因素综合考虑 模拟窖泥功能菌的生长条件,生产人工老窖泥,满 远超过好氧细菌,且各厌氧菌之间存在共生关系; 新老窖泥水分含量差异较小,无明显规律,老窖泥 pH偏低,分析与老窖泥中微生物活动旺盛代谢产酸 有关,老窖泥中有机碳、腐殖酸及N、P等都明显高 于新窖泥。 2.2窖泥功能茵及人工老窖新技术 足窖泥功能菌生理、生化方面及其繁殖过程中对养 分、水分等条件的需求,使窖泥微生物在良好的环 境下繁殖代谢。 窖泥功能菌液应用于人工窖泥生产中,所生产 人工窖泥呈灰褐色或灰黑色,有酯香,有浓郁的老 窖泥气味,手感细腻均匀,无颗粒,镜检含丰富的梭 状芽孢杆菌。窖泥功能菌人工老窖泥技术不仅缩短 了新窖老熟的年限,又克服了单一己酸菌、甲烷菌 从我公司多年的优质老窖泥中分离出己酸菌 (YH—L001)、甲烷菌、丁酸菌、酵母菌等菌株,并不断 对其选育与优化,形成了我公司特有的窖泥功能 菌。应用发酵罐生产窖泥功能菌液,通过不断工艺 优化以及配方的改进,形成了一套成熟的窖泥功能 菌液培养技术。 窖泥功能菌培养流程: 菌种筛选 菌种选育 菌种优化(耐热、耐酒 制作一灭菌 窖泥功能菌种子培养一一级培养基 培养窖泥使酒体出现暴辣的缺陷,明显提高了主体 香味物质己酸乙酯的含量,各种酯类物质的比例协 调,酒体绵柔、丰满。使用人工老窖泥的窖池,当排 酒效果。 精试验)一碳、氮源不同添加量配比试验一培养基 次就能够产出好酒,一到两年就能够达到老窖的产 3新窖老熟新技术 制作一灭菌 接种一培养一二级培养基制作一灭 2.菌一接种一培养一三级大罐培养基制作一灭菌_÷ 接种 培养一应用。 窖泥功能菌液的质量标准: 通过模拟老窖微生态体系,对酿酒新车间窖内 微生态体系进行调控,拾遗补缺,驯化增殖,一方面 通过将窖泥功能菌利用本地的水、土、糟、曲、老窖 泥等进行适应驯化、富集与增殖,以窖养糟;另一方 面利用酯化功能菌来调节酒醅微生物区系及其微生 态环境,以糟养窖;同时辅之以发酵工艺的调整,从 而形成了良好的窖内“多微共酵生态体系”,窖内微 生态体系更趋老窖标准;出酒率保持相对稳定甚至 (1)感官指标:色泽为无色或者灰黄色或淡黄色,具 有浓郁的己酸的特有气味,镜检观察要求大部分为 杆菌。 (2)理化指标:pH≤6。 (3)微生物指标:活菌总数(爪/mL)≥3.0 X 10 。 第五期 雨良 酒 2013 有所提高,升级率显著提高;酒质明显改善,主体风 粮醅_÷冷却(32~35 oC)一加曲(曲和复合培养 味物质显著增加,醇厚感突出,复合感强,己乳比与 己乙比更加协调,酒体结构更加优化,风格更趋绵 柔型白酒标准。 3耐热细菌培养液的应用 3.1耐热菌株的筛选和鉴定 从洋河中高温大曲中筛选到4株耐热菌 (YB002,YB003,YB007,YBO12)生产麸曲的蛋白酶 活性和液化酶活性均较高(见表5);通过形态理化特 征,【 (见表6)和16S rRNA基因序列分析,YB002为 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),YB003、YB007为 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),YB012为地衣芽 孢杆菌(Bacillus licheni ̄ormis)。 表5 4株耐热茵麸曲酶活性 O 6 图4 表 7 理化试验项目 YB002 YB003 YBO07 YB012 3.2耐热细菌培养液的应用 使用数控发酵罐组扩大培养4株耐热细菌,4 株菌的一级(IOL)和二级(IOOL)培养采用单菌种纯 种培养的方式,二级纯种菌液按照一定比例接种三 级(IO00L)培养,生产耐热细菌复合培养液,应用到 酿酒生产中。 取一定量复合培养液喷洒到调味型酒粮醅中, 跟踪检测堆积温度及感官情况,对照组除未喷洒培 养液外其他工艺不变,工艺路线如下。 a岛峨》 液)一抄拌均匀_÷堆积发酵(1 2d) 入窖发酵一 出窖一蒸酒 12 l8 24 3O 36 42 堆积时间/ll 酒醅堆积温度变化情况 酒醅堆积感官变化情况 时间m 感官情况 0-6 酒醅有明显生曲味,酒醅疏松,手感好。 6-12 酒醅生曲味变淡,疏松,表面水分散失较多,干燥。 12-24 酒生曲味基本消失,有淡淡香气产生,表面生成少 量白色斑点状菌丝;堆积内部水分变大表面水分进 一步散失。 24-42 无生曲味,内部酒醅气味怡人,香味复合,并有明显 酒味和香甜味。表面水分散失较多,干燥疏松,内部 水分上升两个点左右。 对堆积酒醅温度变化及感官情况进行跟踪(图 4、表7),喷洒复合培养液堆积,微生物能快速进人 生长繁殖状态,升温相比对照组平缓,升温较快、无 停滞期,且高温持续时间较长。当堆积进行到24h 后,堆积温度达到45—55℃时,堆积酒醅的内部酒醅 气味怡人,香味复合,并有明显酒味和香甜味。 堆积过程创造了微氧、高湿和相对高温的条 件,同时网罗了环境中的微生物,生物酶达到适宜 的作用温度,促使淀粉发酵和蛋白质分解,还伴随 各种其他组分的相互作用、酶促、非酶促化学反应 等。复合培养液中耐热芽孢杆菌具有的高蛋白酶活 性可促使原料中的蛋白质酶解成氨基酸,与还原糖 发生非酶促褐变反应而产生杂环类化合物,从而增 加了酒体中杂环化合物的种类和含量,使酒体丰满 绵柔、香气馥郁。 堆积结束,将堆积粮醅人窖发酵,发酵结束后, 将试验生产方式与对照生产方式产酒情况进行比 较,如表8所示。 第五期 周新虎,等:有益功能微生物在酿酒生产中的研究及应用 表8两种生产方式产酒情况 % B 33.9 34.5 34.5 34.8 2013 细菌、酵母菌:试管斜面 三角瓶扩培一 种子罐一二级培养 三级培养一功能性菌液 I + 项 目 出酒率 34.3 A 35.1 升级率 20.2 21.3 20.7 16.5 16.7 15.9 原料一蒸煮锅一输送机一冷却一圆盘制曲机 烘 干一细菌、酵母曲 注:A:复合培养液粮醅堆积工艺;B:原生产工艺。 使用复合培养液的粮醅堆积工艺,能显著提升 霉菌曲、细菌曲和酵母曲按照一定比例混合 多微功能曲 多微功能曲生产具体应用霉菌1株(曲霉属)、 出酒升级率,出酒率基本保持稳定,所产酒窖香浓 郁,香气复合绵柔醇厚,甘爽尾净,绵柔感突出,复合 培养液在粮醅堆积和窖池发酵阶段产生作用,对提 升酒质效果明显,是公司高档调味酒的重要来源。 表9试验酒样和对照酒样中杂环类化合物分析检测结果 用HS—SPME联合GC—MS分析酒中杂环类化 合物,结果发现(表9),杂环类化合物的含量相比对 照有显著升高,尤其是吡嗪类化合物。复合培养液 中芽孢杆菌的繁殖与发酵产生高活力的蛋白水解 酶和淀粉酶,在发酵过程中将蛋白质和淀粉酶解成 氨基酸和还原糖,直接参与美拉德反应,高温下可 以产生数量众多的杂环类化合物【5]。吡嗪类化合物 单体多具有焙烤香,其香气作用与俗称的“焦香”相 似,吡嗪类化合物是酱香型白酒和芝麻香型白酒中 重要的风味物质之一。本试验中复合培养液应用于 调味型酒醅堆积生产中能有效提高酒中的杂环类 化合物的种类和含量,增加酒的焙烤香和焦香。 4多微功能曲的生产 多微功能曲是公司近几年在功能微生物及混合 固态发酵技术上所取得的科研成果,充分应用现代 生物工程技术与白酒特殊生产工艺相结合,引入机 械化、自动化设备生产调味型多微功能曲。 多微功能曲生产工艺流程: 霉菌:试管斜面一三角瓶扩培 种曲罐一种曲粉碎 原料一蒸煮锅一输送机 冷却 圆盘制曲机一 烘干一霉菌曲 酵母菌6株(产香酵母4株,产酒酵母2株)、细菌4 株(YB002,YB003,YBO07,YB012),分别具有较强 的蛋白酶活力、淀粉酶活力、产酒和产香能力,其中 部分菌株可以产生典型的酱香、浓香和芝麻香型白 酒的香气,所有菌株均自洋河酿酒环境中筛选得 到。将所产霉菌、细菌、酵母菌曲质按一定比例混 合,应用在调味型酒的生产中。 在生产细菌曲时,四株耐热芽孢杆菌能够产生 高活力的蛋白酶,将蛋白质水解成各种氨基酸,进 而产生多种美拉德反应产物,在生产原料中添加一 定量的高蛋白辅料,能够有效的促进美拉德反应的 进行。在培养酵母曲和霉菌曲时,可以采用酒糟取 代部分原料,不仅能有效调整原料的pH,还为微生 物的生长提供了丰富的营养物质。另外,由于酵母 菌生长需要糖较多,在生产原料中添加一定量的玉 米粉或小麦粉补充糖分,并添加少量的无机盐为酵 母生长提供充足的矿物元素。 经过我们大量的生产试验发现,细菌、酵母菌和 霉菌在培养过程中需要根据实际生长情况进行通风 操作,微生物在生长过程中需要耗用氧气,同时会 产生代谢废气,如果通风不当,会抑制微生物的生 长。酵母菌曲质在培养中需要大量通风,因为酵母 菌生长代谢旺盛,需氧量大,会产生大量的二氧化 碳而抑制酵母生长,需要持续通风来提供氧气和排 除二氧化碳;而细菌和霉菌生长对氧气需求量相对 较小,产生的废气也较少,只需根据实际情况间隔 通风,通风过度还会造成培养温度下降,影响微生 物生长及代谢产物的产生。 培养结束后的曲质含水量较大,一般在30%左 右,为了便于储存,防止霉变,要及时进行干燥。考 虑到产品中微生物特性及其产酶活性,应根据不同 曲质选择适宜的干燥温度。一般酵母菌曲和霉菌的 的干燥温度不宜超过35℃,在此干燥温度下,随着 蝴 第五期 周新虎,等:有益功能微生物在酿酒生产中的研究及应用 2013 偶数低碳原子酸为主的复合酸。表10是复合微生 物培养3d的镜检分析结果,其中芽孢菌和短杆菌 较多,主要来自于外加菌,而芽孢菌主要产己酸和 丁酸,形状有梭状和鼓槌状,含有一个或两个芽孢, 菌形粗状;短杆菌主要产乙酸,哑铃状菌形较多。球 菌是富集过程中产生的有益菌系,在菌群中所占比 例较大,对产酸有重要影响。酵母主要是1295汉逊 现了乙酸偏低的原因。结合镜检,芽孢菌数:总菌 数在1:6~1:8之间较好。对产酸发酵来说,并不 是芽孢杆菌越多,己酸的生成就越高,菌体的粗壮 程度及各菌系之间的平衡关系可能才是高产己酸的 关键。 5.3产酸变化趋势 利用数控发酵罐培养复合菌群,探索三种酸的 酵母菌种,能利用原料中的糖分代谢合成一些醇类 及酯类物质,同时能消耗发酵液中部分溶解氧,有 助于提供前体物质及产酸。长杆菌有助于己酸的合 成,但量较大时就会造成发酵液恶臭,丁酸含量上 升。 表1 1 纯种与复合菌发酵产酸对比mg/lOOmL 直链脂肪酸是以每次2个碳原子进行合成的, 所以发酵液中低碳酸主要以乙、丁、己偶数碳原子 酸为主。复合微生物发酵过程中能充分利用不同菌 之间的有利关系,综合转化原料中的营养物质,彼 此之间各取所需,同时转移或消除抑制产物合成的 不利因素,使菌群向所需要的目标产物进行代谢, 因此复合菌群发酵产己酸的含量要远大于纯种发 酵。 5.2产酸稳定性研究 乙丁己己 表3红曲霉复筛结果 麟}{+船叠{酵 代数乙酸 丙酸丁酸戊酸 己酸总菌数芽孢菌数 经几代培养发现复合菌群产己酸的稳定性较 好,丁酸含量波动范围稍小;乙酸是己酸合成代谢 的前体物质,由于每批次原料中营养物质含量稍有 差异,因此乙酸的波动范围稍大,这可能是2代出 变化趋势。 l600 OO 1400 O0 1200 O0 1000 O0 800 O0 600 O0 400 O0 200 O0 O O0 产酸复合菌群是根据代谢所需目标产物和不同 菌种之间的性能差异,在设计培养条件下,经过长 期富集、驯化的结果。功能菌群能协调、利用好之间 有利因素,并通过代谢过程中一些物理环境的改变 或生化机制促进各自生理活性。 发酵初始阶段主要产乙酸,而且生成较快,在64h 达到最大值1 105.54mg/lOOmL;丁酸是在产乙酸后开 始大量生成,72h时达到最大值1013.14mg/lOOmL。当 己酸开始大量合成时,丁酸和乙醇迅速降低,而乙 酸变化较小。136h己酸达到1058.61mg/lOOmL,随后 三种酸平稳下来,这可能表明了三种酸处在一个动 态的平衡状态。乙醇含量随发酵的进行而逐渐降 蝴 低。 5.4复合有机酸的应用 在1 10℃、0.04Mpa真空度下定量分段提取复合 有机酸。复合有机酸液呈乳白色油状,由于是纯生 物复合发酵,酸味纯正、自然,有着老窖泥的香气, 可与酯化酶反应进一步合成生物酯。有机酸发酵液 含有大量有益功能微生物,与窖池相结合能在一定 程度上改善窖内微环境,提高酸、酯含量和白酒品 质,在白酒生产中有着广泛的用途。 6总结 通过多种方式综合利用数十株有益功能微生物 到酿酒生产中,在不改变传统酿酒生产工艺的同时 又有所创新,对白酒质量的提升做出贡献。强化大 曲相对传统曲菌丝更为饱满,曲香更加突出、浓郁, 第4O卷第5期 2 0 1 3年9月 酿 酒 Vo1.40.№.5 LIQUOR MAKING Sep.,2013 文章编号:1002—81 10(2013)05—0040—03 特香型大曲中纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、酯化酶 活力变化规律的研究 刘建文,吴生文,朱力红,严(江西四特酒有限责任公司技术部,江西樟树伟 331200) 摘要:gK踪检测了不同存储期特香型大曲中纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、酯化酶活力,并通过综合分析比较 得出结论:储存3 ̄4个月的大曲,其纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、酯化酶的活力均达到最好状态,从而为大曲 存储期和相关酶活力的质量标准制订提供了有力的理论依据。 关键词:纤维素酶;半纤维素酶;蛋白酶;酯化酶 中图分类号:TS262.3;TS261.11;TS201.2 文献标识码:B 曲为酒之骨,大曲是我国固态法白酒生产常使 香型大曲的特点是,利用面粉、麦麸做培养基,加 水、酒糟压制成块,室内培养,让自然界各种微生物 在上面富集生长,以产生白酒生产所需要的各种各 收稿日期:2013—06—22 样的酶,经适当储存,即成大曲,存放一段时间后即 酶活力的直接影响到白酒的出酒率和白酒质量。也 用的一种糖化和发酵剂,其生产历史发展悠久。特 用于生产。不同存放时间的大曲酶活力不一,而各种 就是说,酶活力大小是衡量大曲质量优劣的关键性 指标。所以,纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、酯化酶 在不同储存期的酶活力大小的测定具有十分重要的 现实意义,开展大曲酶活力的监控能更好的应用于 生产,从而实现提质增效。 作者简介:刘建文(1965一),男,湖南省南县人,教授级高级工程师,江西省 白酒评委,广州市科技与信息局科技专家,科普专家。现侮 四特酒有限责任 公司技术部经理。 本文跟踪选取了储存一至十二个月的特香型大 是冰山一角,要想真正的弄清酿酒微生物的本质、 使用强化大曲的窖池温度变化完全符合“前缓、中 挺、后缓落”的最佳状态;窖泥功能菌液及人工老窖 泥新技术,可以有效缩短新窖老熟的时间,酒体绵 柔、丰满,各种酯类物质的比例协调;耐热细菌培养 液在调味型酒的堆积和窖池发酵阶段产生作用,可 了解参与发酵的各种微生物所起的作用,最终完全 可控的利用微生物酿酒,还有相当多的工作要做, 需要全公司,全行业,乃至其他领域的共同努力,才 能更好的促进白酒行业的发展。 【参考文献】 【1]魏景超.真菌鉴定手册【M].上海科学技术出版社,1979. 【2]张纪忠,微生物分类学研究者,黄静娟馓生物分类学[M】.复旦大学 出版社,1990. 以有效促进美拉德反应,提升酒质效果明显,是公 司高档调味酒的重要来源;多微功能曲的生产是现 代生物工程技术和传统酿酒工艺的完美结合,应用 定向筛选的功能菌株,为调味型酒的生产提供定向 专用曲;驯化功能菌群综合利用酿酒副产物生产复 合有机酸,实现副产物的循环利用和变废为宝,也 [31中国科学院微生物研究所常见与常用真菌编写组.常见与常用真 菌[M].北京:科技出版社,1973. [4]沈怡方.白酒生产技术全书[M]一E京:中国轻工业出版社,1998. 为天然香精香料的生产提供了一个全新的方向。 白酒生产采用独特的多菌种固态静止、自然发 酵技术,具有独特的魅力和神秘感,对其中微生物 的研究具有极高的理论和应用价值。洋河酒厂在酿 酒微生物的研究和利用上做了大量工作,也取得了 一[5]卢振营,葛少华,王晓江,等.功能菌在清香型宝丰酒生产中的应用 研究[J].酿酒科技.2012(4):72—75. [6]甘广东,朱超,杨勇等.复合微生物菌群在白酒酿造副产物中的应 用 酿酒科技,2013,1:77—81 [7】岳思青,徐廷婷,侯瑞青等.不同富集和分离培养条件下的含酚水 处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析[J】.微生物学通报, 20o9。36(4):498—504 些成绩,但是距离揭开酿酒微生物的神秘面纱只 瓣