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中华蜜蜂MRJP7基因的原核表达及多克隆抗体的制备

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第26卷第2期 2008年4月 上海交通大学学报(农业科学版) JOURNAL OF SHANGHAI JLA0T0NG UNIVERSITY(AGRICULTURAL SCIENCE) Vo1.26 No.2 Apr.2008. 文章编号:1671—9964(2008)02—0109—05 中华蜜蜂MRJP7基因的 原核表达及多克隆抗体的制备 李艳,陈艳霞,沈立荣,张传溪 (浙江大学昆虫科学研究所,杭州3 10029) 摘要:用PCR方法从含中华蜜蜂Accm ̄p7基因的质粒DNA模板中扩增出MPdP7成熟肽编码区片段,将该片段克隆入原核 表达载体pGEX一4T一2,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行融合表达,SDS—PAGE和薄层扫描显示,该基因得到高效 表达,表达产物大小约为66 kDa,占细胞总蛋白的22.8%。利用割胶回收的方法,获得目的蛋白,注射兔子制备多克隆抗体,并 利用所获抗体进行Western blot印迹分析,检测MRJPs,获得特异性条带。 关键词:中华蜜蜂;蜂王浆;AccMRJP7;原核表达:多克隆抗体 中图分类号:¥892 文献标识码:A Prokaryotic Expression of mrs 7 of ap/s cerana Cerana an rreparation Its cerana and Preparation of Its Polyclonal Antibodyl ti bo LI Yan,CHEN Yan-xia,SHEN Li-rong,ZHANG Chuan-xi (Institute of Insect Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China) Abstract:The coding region of MR3『P7 mature peptide was amplified by PCR from Apis cerana cerana cDNA library and cloned into the prokaryotic expression vector pGEX一4T一2 for fusion expression in E.coli.The SDS-PAGE and thin—layer scanning results showed that t}le expressed GST—MPdP7 fusion protein was about 66 kDa in size and about 22.8%in propo ̄ion to the total bacterial proteins.The expressed products were retrieved from the SDS—PAGE gels and used to immunize the rabbit to produce the polyclonal antibody against MRJPs.The titer of the antibody was evaluated by ELISA method and its specificity was confirmed by Western blot analysis. Key words:Apis cerana cerana;royal jelly;AccMRJP7;prokaryotic expression;polyclonal antibody 蜂王浆(royal ielly,R3)是蜜蜂头部营养腺(工蜂 咽下腺、上颚腺等)的分泌物【 ,在蜂群中是蜂王及1 至3日龄蜜蜂幼虫的食物.它不仅具有重要的营养 这一基因家族还包含1个编码1条不完整多肽的基 因,研究者将其命名为m 嘲。蜂王浆所具有的重 要医疗保健作用和生物学功能。可能与王浆中_的一 些MtLIPs密切相关f9】。主要王浆蛋白基因克隆及功 能研究已成为蜜蜂生物学研究的热点之一。 中华蜜蜂IApi ̄cerana cerana)简称中蜂。是我国 特有的蜜蜂品种,是东方蜜蜂最重要的一个亚种。西 方蜜蜂主要王浆蛋白MRJPs的功能研究已有相关 功能,而且在蜜蜂的级型分化中起决定性作用[31。 蛋白质是蜂王浆最主要的组分之一。由水溶性蛋白 (water soluble proteins,WSPs)和非水溶性蛋白组 成.其中水溶性蛋白占总蛋白含量的46%~89%[451, 为王浆蛋白的主要部分,称为MtLIPs(major royal ielly proteins)[ ̄71。至今已报道编码西方蜜蜂MtLIPs 蛋白家族的基因共有9个,即m咖1~9,除此之外, 收稿日期:2007-03—20 基金项目:国家自然基金项目(30271008) 报道【 .而对东方蜜蜂.尤其是对中华蜜蜂MRJPs 的研究相对滞后.至今除我们实验室报道过一种中 作者简介:李艳(1983一),女,河南洛阳人,硕士研究生,研究方向:昆虫分子生物学;张传溪为本文通讯作者。E-mail:chxzhang@zju.edu.cn. 维普资讯 http://www.cqvip.com 110 上海交通大学学报(农业科学版) 第26卷 华蜜蜂王浆小肽Apsimin的原核表达外㈣.还未见 单个中蜂主要王浆蛋白基因表达和功能方面研究的 报道。据报道东西方蜜蜂的王浆组成成分有很大差 异【 .东西方蜜蜂蜂王交叉饲养实验也验证了这一 观点【垌。但东、西方蜜蜂已知的几种王浆蛋白之间氨 基酸序列有很大的同源性,而且东、西方蜜蜂不同王 浆蛋白都属于一个蛋白家族,互相之间的氨基酸序 列也很相似 嘲。 本研究在中华蜜蜂工蜂头部cDNA文库的大规 模EST测序和分析的基础上。从文库中筛选出含编 码中华蜜蜂主要王浆蛋白MRJP7基因 ccmr ̄7)的 克隆。AccMRJP7基因cDNA全长1 557 bp,含1个 长1 350 bp的开放阅读框(ORF)。可以编码1个含 450个氨基酸残基的多肽,预测分子量为49.5 kDa。 本研究对AccMRJP7基因进行克隆和在大肠杆菌中 表达,表达产物通过割胶回收制备了AccMRJP7的 多克隆抗体.以便为以后中华蜜蜂主要王浆蛋白基 因功能的研究提供条件。 1材料与方法 1.1供试材料 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株TG1和BL21 (DE3)、pGEX一4T一2载体由浙江大学昆虫科学研究 所分子生物学实验室保存:DNA性内切酶 BamH I和Xho I、DNA Ma ̄er、pMD18一T载体、T4 DNA Ligase及相应反应缓冲液为Takara上海宝生 物工程(大连)公司产品;DNA快速纯化/回收试剂 盒为北京鼎国生物技术有限责任公司产品;电泳级 琼脂糖、丙烯酰胺、N,N’亚甲叉双丙烯酰胺、N,N, N’,N’一四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠 (SDS)和OPD为上海生工生物工程公司产品;辣根 过氧化酶底物DAB购自Promega公司;PVDF购自 Millipore公司:弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为 Sigma公司产品:HRP标记的羊抗兔IgG购自晶美 公司;其他化学试剂均为国产分析纯;用于制备多克 隆抗体的白毛黑眼兔由浙江中医药大学实验动物中 心提供。意大利蜜蜂(Apu 厂er0。王浆由浙江大学 养蜂场采集。一80℃保存备用。 1.2方法 1.2.1 PCR扩增及产物的纯化以筛选的含AC— cm@7克隆的质粒DNA为模板进行PCR扩增Ac— cMRJP7成熟肽编码区: 上游引物Pl(Accmr ̄7 序列为:5 一ggatcc atg GCCA l’IIG l’I’CGAAAAAA I’I℃一3 下游引物P2 ccmr ̄7R)序列为:5 一ctcgag CTAATrAATrAAAGAGTrTATrG一3 其中引物P1引入起始密码子ATG和BamH I 酶切位点(小写字母所示),引物P2引入XhoI酶切 位点(小写字母所示)。引物由上海生工生物工程公 司合成。扩增条件为93 0C 3 min预变性后。94 0C 50 Sx56 0C 45 Sx72 0C 1 min共35个循环.最后1 轮循环完成后再72 0C延伸10 min。反应完毕,1%琼 脂糖凝胶电泳检查扩增结果,紫外灯下切取目的 DNA片段.用DNA快速纯化/回收试剂盒回收目的 片段,步骤按试剂盒说明书进行。 1.2.2 Accmr]p7基因原核表达载体的构建将回 收的目的DNA片段连至pMD18一T载体.转化TG1 感受态细胞,涂布含100 g-mL Ampicillin(Amp)的 LB平板.挑取单菌落至含有同样浓度Amp的液体 培养液中.抽提质粒,用BamHI和Xhol双酶切质 粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收酶切产物中的 MRJP7基因片段(1 300 bp)。再用BamHI和 I 双酶切pGEX.4T一2质粒,回收pGEX一4T一2片段。 用T4 DNA Ligase将两双酶切回收产物于16 0C连 接1夜。将连接产物转化TG1感受态细胞,抽提质 粒,用BamHI和 I双酶切所得质粒。1%琼脂糖 凝胶电泳鉴定连接结果。 1.2.3 目的蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组表 达质粒转化人BL21(DE3)感受态细胞中.涂布菌液 于含100 g・mL Amp的LB平板中,挑取白色菌 落,接种于含同等质量浓度Amp的LB液体培养基 中,37 0C振荡培养过夜活化。按每支试管6 mL含 Amp的LB液体培养基加入100 L菌液的量,转接 活化菌液。共接4支试管,37 0C、220 r・min 振荡培 养至OD60。:0.6—1.0,按一定浓度梯度加入IPTG(40 mg・mL ),37 0C、180 r-min 诱导培养4 h。每个浓 度梯度下分别取1 mL菌液.8 000 r・min-・离心5 min收集菌体,弃上清后,加入PBS 200 L震荡悬 浮沉淀。8 000 r・min 离心5 min。弃上清,再加入等 体积的PBS和2xSDS凝胶加样缓冲液f0.1 mol・L Tris—HCl,2%2一ME。4%SDS,0.2%溴酚蓝,20%甘 油,pH 6.8),混匀后100℃煮沸10 min。12 000 r・ min 离心1 min,取其上清液,置一20 0C备用。诱导 产物经10%的SDS—PAGE电泳.用考马斯亮蓝R一 250染色2 h后,室温摇床上脱色至背景色脱尽。 1.2.4 AccMRJP7多克隆抗体的制备将诱导表达 产物用超声波破碎后.取上清和沉淀进行SDS— 维普资讯 http://www.cqvip.com

维普资讯 http://www.cqvip.com 112 上海交通大学学报(农业科学版) 第26卷 2.4 ELISA效价测定 多克隆抗体的稀释采用加倍法.第1次稀释 100倍,第2次200倍,依次类推。所表达蛋白在抗 体稀释倍数为1.024x10 时,样品0D诬平均值仍大 于阴性对照0D诬值的2倍,如表1所示。 表1 GST—AccMI P7融合蛋白多克隆抗体 效价的ELISA检测 Tabel 1 Titer determination of aIIti—GST— AccMRJP7 polyclonal antibody by ELISA 稀释 倍数100 200 400 800 1600 3200 6400 128002560051200102400204800 (倍) 阳 1.1240.9340.8220・5170.3220・191 o'12 0.083 0,064 0.056 0.081 0,057 照 2.22 2.093 1.923 1.884 1.699 1.324 0.979 0.618 0.35l 0.2l6 0.157 0.097 2.1052.1362.118 1.896 1.638 1.323 0,957 0.603 0.362 0,225 0.147 0.094 2.092 2.16 2.126 1.848 1.66l 1.299 0.916 0.587 0.352 0.21 1 0.129 0.088 平 均2.1392.1302.056 l 876 1.666 l_315 0.954 0.603 0.355 0.217 0.144 0.093 值 阴 筹0.2970.1680.1420.0780.061 0.053 0.049 0.048 0.049 0.017 0.049 0.054 照 2.5 Western blot鉴定 将制备的GST—AccMRJP7多抗与意蜂王浆蛋 白样品和中蜂主要王浆蛋白基因Accmrjp5的真核 表达产物进行Western blot分析,结果显示该多克 隆抗体能识别意蜂王浆蛋白样品中多种主要王浆 蛋白.而且能与在真核系统中表达的AccMRJP5蛋 白特异性结合,但不与2对照发生免疫反应,如图 3B所示 3讨论 鉴于蜂王浆组成的复杂性,长期以来研究者都 是从其整体水平上进行功能研究。随着社会发展和 生活水平的不断提高,人们对农产品已从数量追求 转变为质量和特色的追求,开始注重高品质、纯天 然的健康生活。蜂王浆无论是作为一种保健品,还 是被视为优秀的生物学实验材料,都具有重要的研 究价值.而主要王浆蛋白MILlPs作为王浆最主要的 组分.其研究显得尤为重要。 目前.西方蜜蜂主要王浆蛋白是研究热点,东 方蜜蜂和西方蜜蜂的王浆成分不同 阍,深入开展东 方蜜蜂主要王浆蛋白的相关研究非常必要,中华蜜 蜂作为东方蜜蜂种下最重要的1个亚种,其主要王 浆蛋白的研究具有重要的科学伤值,已有的有关中 A B 图3 AccMRJP7多克隆抗体与意蜂王浆蛋白样品和 Accmrjp5基因真核表达产物的Western blot印迹分析 A:意蜂王浆蛋白样品的SDS—PAGE图。M为标准蛋白分子量 Marker,RJ所示为意蜂王浆蛋白样品B:Westenr blot印迹分析。ftJ 所示为意蜂王浆蛋白,泳道1和2为对照,分别为正常粉纹夜蛾 (Trlchoplusia ni,Tn)细胞抽提物和Tn细胞感染对照病毒后抽提物, 泳道3为Tn细胞感染Accmrjp5重组病毒后的表达产物(如箭头所 示)。AmMRJP:意大利蜜蜂(Api ̄, ff rⅡ】主要王浆蛋白,不同MR aP 对应电泳条带标注根据Schmitzova等 :AccMRaP:中华蜜蜂(Api ̄ cerana cerana)主要王浆蛋白 Fig.3 Western blot analysis of the royal ieily of Apis, ff ra and the expressed product of Accmr ̄5 gene in insect ceils using anti—AecMRJP7 polyclonal antibody A:SDS—PAGE of the royal jelly of Apis m*ll ̄ra.M,protein market ftJ,royal ielly of Ap/s, 胁屉r(t B:Westem blot analysis using nati—AccMRaP7 polyclonal antibody. RJ,royal jelly ofApis mf ra;Ianel,Trichoplusia ni(Tn)cell extracts;I.ane2,extracts of Tn cens infected with Bacmid;Lane3, extracts of Tn cells ifnectde with the recombinant baculoviors cont ̄ning Accmrjp5 gene 蜂MRJPs的研究仅仅是在个别基因的序列分析方 面的报道 81.而未有与中蜂MRJPs基因表达方面 相关的报道.且以往的表达和功能研究集中在蜂王 浆主要蛋白中含量最高的几种蛋白MRJP1、MRJP2 和MRJP3t9 2J9/,而对一些含量偏低.不易被检测到 的蛋白,即使是在西方蜜蜂MRJPs的功能研究中也 未见报道。Schmitzova等[61通过对意蜂王浆进行 SDS—PAGE分离后指出MRJP1、MRJP2、MRJP3s和 MRJP5s 4种主要王浆组分的相对含量分别为: 31%、16%、26%和9%I16,可见.其他组分的含量十分 有限,为了获取含量相对较少的蛋白组分.应用分 子生物学方法进行体外表达是一条重要途径 本研 究通过优化表达条件.在大肠杆菌中成功表达了中 蜂MRJP7基因,为MRJP7基因的功能研究打下了 基础。同时利用表达产物制备出MRIP多克隆抗体, 为多种MRJPs研究和检测提供了材料。根据Ac— cMRJP7蛋白序列在NCBI中进行BLAST搜索后发 现,AccMRJP7与意大利蜜蜂4种主要王浆蛋白 AmMRJP1、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5的序 列相同性分别为67%、72%、66%和78%,与已报道 的AccMRJP5蛋白序列【 81的同源性为73%.本文中 维普资讯 http://www.cqvip.com

第2期 李艳.等:中华蜜蜂MRJF7基因的原核表达及多克隆抗体的制备 113 图3的Western blot结果也说明MRJP7多克隆抗体 可以检测多种MRJPs。证明它们之间存在较高的同 源性。 蜜蜂基因组的全序列已经公布。之后蜜蜂基因 功能及王浆蛋白功能的研究必将成为热点。由于蜂 王浆主要蛋白家族所包含的王浆蛋白种类比较多. 给研究工作带来了一定的挑战。接下来对M Ps功 能方面的研究还需要做大量的工作。 AccMRJP7是一种在王浆蛋白中含量很低的蛋 白。对其蛋白的成功表达和抗备.有助于开展 M P7独特功能的研究。但本研究也同时说明。在 大肠肝菌中表达的蛋白为不溶性的包涵体蛋白.直 接用于进行蛋白性质和生物学功能研究有难度。为 此我们正在对该基因进行真核表达研究。另外,本 研究制备的AccMRJP7多克隆抗体对意蜂王浆的 Western blot检测表明。M P1、MRJP2、MRJP3s和 MRJP5等王浆蛋白.由于同源性很高.有很强的交 叉反应.因此如果要深入检测和研究单个基因产物 的特性.制各能够区别不同M Ps的特异性强的单 克隆抗体是必要的。 参考文献: 【1】Lensky Y,Rakover Y.Separate protein body compartments of the worker honeybee(ap/ ̄,础ZZ ra L.)【J].Comparative Biochemistry Physiology,1983,75(4):607-615. 【2】Knecht D,Kaatz H H.Patterns of larval food production by hypopharyngeal ands in adult worker honey bees[J】. Apidologie,1990,21(5):457_468. 【3】Bmuwers E W M,Ebert R,Beetsma J.Behaviorla and physiological aspects of nurse bees in mlation to the composition of larvae food dunng caste diferentiation in the honeybee[J1.Journal of Apicuhure Research,1987, 26(1):1 1-23. [4】Tomoda G,Matsuyama J,Matsuka M.Studies on protein in royal jelly.2.Fractionation on water-soluble protein by DEAE-cellulose chromatography,sel Fd ̄afion and disc electrophoresis【J].Journal of Apiculture Research,1997, 16:125-130. [5】Takenaka T,Echigo T.Proteins and peptides in royal jelly 【J].Nippon Nogelkagaku Kaishi,1983,57:1203—1209. 【6】Schmi ̄ova J,Klaudiny J,Albert S.A family of major royal jelly proteins ofthe honeybee Apis mellfiera L【J].Cell Molecular Life Science,1998,54:1020—1030. [77] Gordon FT,CoUn A L.The chemical nature of royaljelly 【J].Bicohemical Journal,1940,34(8-9):1 155—1 162. [88] Drapeau M D,Albert S,et 1a.Evolution of the Yellow/Major Royal JeUy Protein family and the emergence of social behavior in honey bees【J].Genome Research,2006,16(1 1): 1385-1394. [9]1wao O,Yoshifumi T,et 1a.Major royaljelly protein 3 modulates immune resopnses in vitro and n vivo【J]. Life Sciences,2003,73(16):2029—2045. 【10】Kucharski R,Maleszka R,Hayward D C,et 1a.A royal jelly protein is expressed in a subset of Kenyon cells in hte mushroom bodies of hte honey bee brain【J]. Naturwissenschaften,1998,85(7):343—346. 【1 1】Albert S,Klaudiny J,Simuth J.Molecular characterization of MRJP3,highly oplymorphic protein of honeybee(ap/ ̄ ,础 ra)royal jelly【J].Insect Biochemistry Moleculra Biology,1999,29(5):427-434. 【12】Simuth J.Some properties of hte main protein of honeybee (ap/ ̄胱z ra)royal jelly Apidologie,2001,32:69—8O. 【13】邢丽苹,沈立荣,鸟晓云,等.中华蜜蜂王浆多肽Ap ̄imin 基因转录、克隆与表达研究【J].上海交通大学学报(农业 科学版),2006,24(5):46O_464. 【14】Takenaka T,Takenaka Y.Royal jelly from Apis cerana japonica nad Apis mellfiera【J].Bioscience Biotechnology Bicohemistry,1996,6O(3):518-520. [15】Pothiehot S,Wongsiir S.Attempts in queen rearing of Apis ceranalarvae inApis,础观 ra colonies andApis ̄uifera larvae in Apis cerana colonies【J].Asian Apiculture,1993, 128-133. 【16】苏松坤,陈盛禄,钟伯雄,等冲华蜜蜂m咖1 cDNA的克 隆及其序列分析【J].遗传学报,2004,31(11):1248—1253. 【17】苏松坤,陈盛禄,钟伯雄,等.中华蜜蜂m咖3 cDNA的克 隆及序列分析叽冲国农业科学,2005,38(3):612—618. 【18】Su S Albert S,Chen S L'et 1a.Moleculra nad analysis offour cDNAs from the heads ofApis cerana cerana nurse honeybees cdoing for major royal jelly proteins【J]. Apidologie,2005,36:389-401. 【19】Imjongjirak C,Klinbunga S,Sittiprnaeed S.Cloning, expression and genomic organization of genes encoding major royaljelly protein 1 and 2 ofthe honey bee p cerana)[ ̄.Joumal of Bichemistry nad Molecular Biology, 2005.38(1):49—57. 

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