中华蜜蜂MRJP7基因的原核表达及多克隆抗体的制备

第２６卷第２期　２００８年４月　上海交通大学学报（农业科学版）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＬＡ０Ｔ０ＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）　Ｖｏ１．２６　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２００８．　文章编号：１６７１—９９６４（２００８）０２—０１０９—０５　中华蜜蜂ＭＲＪＰ７基因的　原核表达及多克隆抗体的制备　李艳，陈艳霞，沈立荣，张传溪　（浙江大学昆虫科学研究所，杭州３　１００２９）　摘要：用ＰＣＲ方法从含中华蜜蜂Ａｃｃｍ￣ｐ７基因的质粒ＤＮＡ模板中扩增出ＭＰｄＰ７成熟肽编码区片段，将该片段克隆入原核　表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一２，在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行融合表达，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和薄层扫描显示，该基因得到高效　表达，表达产物大小约为６６　ｋＤａ，占细胞总蛋白的２２．８％。利用割胶回收的方法，获得目的蛋白，注射兔子制备多克隆抗体，并　利用所获抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ印迹分析，检测ＭＲＪＰｓ，获得特异性条带。　关键词：中华蜜蜂；蜂王浆；ＡｃｃＭＲＪＰ７；原核表达：多克隆抗体　中图分类号：￥８９２　文献标识码：Ａ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｒｓ　７　ｏｆ　ａｐ／ｓ　ｃｅｒａｎａ　Ｃｅｒａｎａ　ａｎ　ｒｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉｔｓ　ｃｅｒａｎａ　ａｎｄ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｔｓ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙｌ　ｔｉ　ｂｏ　ＬＩ　Ｙａｎ，ＣＨＥＮ　Ｙａｎ－ｘｉａ，ＳＨＥＮ　Ｌｉ－ｒｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｕａｎ－ｘｉ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＭＲ３『Ｐ７　ｍａｔｕｒｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＧＥＸ一４Ｔ一２　ｆｏｒ　ｆｕｓｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｔｈｅ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎｄ　ｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔ｝ｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＧＳＴ—ＭＰｄＰ７　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　６６　ｋＤａ　ｉｎ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ａｂｏｕｔ　２２．８％ｉｎ　ｐｒｏｐｏ￣ｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ｇｅｌｓ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉｚｅ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ＭＲＪＰｓ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ；ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ；ＡｃｃＭＲＪＰ７；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　蜂王浆（ｒｏｙａｌ　ｉｅｌｌｙ，Ｒ３）是蜜蜂头部营养腺（工蜂　咽下腺、上颚腺等）的分泌物【　，在蜂群中是蜂王及１　至３日龄蜜蜂幼虫的食物．它不仅具有重要的营养　这一基因家族还包含１个编码１条不完整多肽的基　因，研究者将其命名为ｍ　嘲。蜂王浆所具有的重　要医疗保健作用和生物学功能。可能与王浆中＿的一　些ＭｔＬＩＰｓ密切相关ｆ９】。主要王浆蛋白基因克隆及功　能研究已成为蜜蜂生物学研究的热点之一。　中华蜜蜂ＩＡｐｉ￣ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ）简称中蜂。是我国　特有的蜜蜂品种，是东方蜜蜂最重要的一个亚种。西　方蜜蜂主要王浆蛋白ＭＲＪＰｓ的功能研究已有相关　功能，而且在蜜蜂的级型分化中起决定性作用［３１。　蛋白质是蜂王浆最主要的组分之一。由水溶性蛋白　（ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＷＳＰｓ）和非水溶性蛋白组　成．其中水溶性蛋白占总蛋白含量的４６％～８９％［４５１，　为王浆蛋白的主要部分，称为ＭｔＬＩＰｓ（ｍａｊｏｒ　ｒｏｙａｌ　ｉｅｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）［￣７１。至今已报道编码西方蜜蜂ＭｔＬＩＰｓ　蛋白家族的基因共有９个，即ｍ咖１～９，除此之外，　收稿日期：２００７－０３—２０　基金项目：国家自然基金项目（３０２７１００８）　报道【　．而对东方蜜蜂．尤其是对中华蜜蜂ＭＲＪＰｓ　的研究相对滞后．至今除我们实验室报道过一种中　作者简介：李艳（１９８３一），女，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：昆虫分子生物学；张传溪为本文通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｘｚｈａｎｇ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．　维普资讯 http://www.cqvip.com １１０　上海交通大学学报（农业科学版）　第２６卷　华蜜蜂王浆小肽Ａｐｓｉｍｉｎ的原核表达外㈣．还未见　单个中蜂主要王浆蛋白基因表达和功能方面研究的　报道。据报道东西方蜜蜂的王浆组成成分有很大差　异【　．东西方蜜蜂蜂王交叉饲养实验也验证了这一　观点【垌。但东、西方蜜蜂已知的几种王浆蛋白之间氨　基酸序列有很大的同源性，而且东、西方蜜蜂不同王　浆蛋白都属于一个蛋白家族，互相之间的氨基酸序　列也很相似　嘲。　本研究在中华蜜蜂工蜂头部ｃＤＮＡ文库的大规　模ＥＳＴ测序和分析的基础上。从文库中筛选出含编　码中华蜜蜂主要王浆蛋白ＭＲＪＰ７基因　ｃｃｍｒ￣７）的　克隆。ＡｃｃＭＲＪＰ７基因ｃＤＮＡ全长１　５５７　ｂｐ，含１个　长１　３５０　ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）。可以编码１个含　４５０个氨基酸残基的多肽，预测分子量为４９．５　ｋＤａ。　本研究对ＡｃｃＭＲＪＰ７基因进行克隆和在大肠杆菌中　表达，表达产物通过割胶回收制备了ＡｃｃＭＲＪＰ７的　多克隆抗体．以便为以后中华蜜蜂主要王浆蛋白基　因功能的研究提供条件。　１材料与方法　１．１供试材料　大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）菌株ＴＧ１和ＢＬ２１　（ＤＥ３）、ｐＧＥＸ一４Ｔ一２载体由浙江大学昆虫科学研究　所分子生物学实验室保存：ＤＮＡ性内切酶　ＢａｍＨ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｉ、ＤＮＡ　Ｍａ￣ｅｒ、ｐＭＤ１８一Ｔ载体、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ及相应反应缓冲液为Ｔａｋａｒａ上海宝生　物工程（大连）公司产品；ＤＮＡ快速纯化／回收试剂　盒为北京鼎国生物技术有限责任公司产品；电泳级　琼脂糖、丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ’亚甲叉双丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ，　Ｎ’，Ｎ’一四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、十二烷基硫酸钠　（ＳＤＳ）和ＯＰＤ为上海生工生物工程公司产品；辣根　过氧化酶底物ＤＡＢ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＰＶＤＦ购自　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为　Ｓｉｇｍａ公司产品：ＨＲＰ标记的羊抗兔ＩｇＧ购自晶美　公司；其他化学试剂均为国产分析纯；用于制备多克　隆抗体的白毛黑眼兔由浙江中医药大学实验动物中　心提供。意大利蜜蜂（Ａｐｕ　厂ｅｒ０。王浆由浙江大学　养蜂场采集。一８０℃保存备用。　１．２方法　１．２．１　ＰＣＲ扩增及产物的纯化以筛选的含ＡＣ—　ｃｍ＠７克隆的质粒ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增Ａｃ—　ｃＭＲＪＰ７成熟肽编码区：　上游引物Ｐｌ（Ａｃｃｍｒ￣７　序列为：５　一ｇｇａｔｃｃ　ａｔｇ　ＧＣＣＡ　ｌ’ＩＩＧ　ｌ’Ｉ’ＣＧＡＡＡＡＡＡ　Ｉ’Ｉ℃一３　下游引物Ｐ２　ｃｃｍｒ￣７Ｒ）序列为：５　一ｃｔｃｇａｇ　ＣＴＡＡＴｒＡＡＴｒＡＡＡＧＡＧＴｒＴＡＴｒＧ一３　其中引物Ｐ１引入起始密码子ＡＴＧ和ＢａｍＨ　Ｉ　酶切位点（小写字母所示），引物Ｐ２引入ＸｈｏＩ酶切　位点（小写字母所示）。引物由上海生工生物工程公　司合成。扩增条件为９３　０Ｃ　３　ｍｉｎ预变性后。９４　０Ｃ　５０　Ｓｘ５６　０Ｃ　４５　Ｓｘ７２　０Ｃ　１　ｍｉｎ共３５个循环．最后１　轮循环完成后再７２　０Ｃ延伸１０　ｍｉｎ。反应完毕，１％琼　脂糖凝胶电泳检查扩增结果，紫外灯下切取目的　ＤＮＡ片段．用ＤＮＡ快速纯化／回收试剂盒回收目的　片段，步骤按试剂盒说明书进行。　１．２．２　Ａｃｃｍｒ］ｐ７基因原核表达载体的构建将回　收的目的ＤＮＡ片段连至ｐＭＤ１８一Ｔ载体．转化ＴＧ１　感受态细胞，涂布含１００　ｇ－ｍＬ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ａｍｐ）的　ＬＢ平板．挑取单菌落至含有同样浓度Ａｍｐ的液体　培养液中．抽提质粒，用ＢａｍＨＩ和Ｘｈｏｌ双酶切质　粒，１％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收酶切产物中的　ＭＲＪＰ７基因片段（１　３００　ｂｐ）。再用ＢａｍＨＩ和　Ｉ　双酶切ｐＧＥＸ．４Ｔ一２质粒，回收ｐＧＥＸ一４Ｔ一２片段。　用Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ将两双酶切回收产物于１６　０Ｃ连　接１夜。将连接产物转化ＴＧ１感受态细胞，抽提质　粒，用ＢａｍＨＩ和　Ｉ双酶切所得质粒。１％琼脂糖　凝胶电泳鉴定连接结果。　１．２．３　目的蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组表　达质粒转化人ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞中．涂布菌液　于含１００　ｇ・ｍＬ　Ａｍｐ的ＬＢ平板中，挑取白色菌　落，接种于含同等质量浓度Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基　中，３７　０Ｃ振荡培养过夜活化。按每支试管６　ｍＬ含　Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基加入１００　Ｌ菌液的量，转接　活化菌液。共接４支试管，３７　０Ｃ、２２０　ｒ・ｍｉｎ　振荡培　养至ＯＤ６０。：０．６—１．０，按一定浓度梯度加入ＩＰＴＧ（４０　ｍｇ・ｍＬ　），３７　０Ｃ、１８０　ｒ－ｍｉｎ　诱导培养４　ｈ。每个浓　度梯度下分别取１　ｍＬ菌液．８　０００　ｒ・ｍｉｎ－・离心５　ｍｉｎ收集菌体，弃上清后，加入ＰＢＳ　２００　Ｌ震荡悬　浮沉淀。８　０００　ｒ・ｍｉｎ　离心５　ｍｉｎ。弃上清，再加入等　体积的ＰＢＳ和２ｘＳＤＳ凝胶加样缓冲液ｆ０．１　ｍｏｌ・Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ，２％２一ＭＥ。４％ＳＤＳ，０．２％溴酚蓝，２０％甘　油，ｐＨ　６．８），混匀后１００℃煮沸１０　ｍｉｎ。１２　０００　ｒ・　ｍｉｎ　离心１　ｍｉｎ，取其上清液，置一２０　０Ｃ备用。诱导　产物经１０％的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳．用考马斯亮蓝Ｒ一　２５０染色２　ｈ后，室温摇床上脱色至背景色脱尽。　１．２．４　ＡｃｃＭＲＪＰ７多克隆抗体的制备将诱导表达　产物用超声波破碎后．取上清和沉淀进行ＳＤＳ—　维普资讯 http://www.cqvip.com

维普资讯 http://www.cqvip.com １１２　上海交通大学学报（农业科学版）　第２６卷　２．４　ＥＬＩＳＡ效价测定　多克隆抗体的稀释采用加倍法．第１次稀释　１００倍，第２次２００倍，依次类推。所表达蛋白在抗　体稀释倍数为１．０２４ｘ１０　时，样品０Ｄ诬平均值仍大　于阴性对照０Ｄ诬值的２倍，如表１所示。　表１　ＧＳＴ—ＡｃｃＭＩ　Ｐ７融合蛋白多克隆抗体　效价的ＥＬＩＳＡ检测　Ｔａｂｅｌ　１　Ｔｉｔｅｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａＩＩｔｉ—ＧＳＴ—　ＡｃｃＭＲＪＰ７　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｙ　ＥＬＩＳＡ　稀释　倍数１００　２００　４００　８００　１６００　３２００　６４００　１２８００２５６００５１２００１０２４００２０４８００　（倍）　阳　１．１２４０．９３４０．８２２０・５１７０．３２２０・１９１　ｏ＇１２　０．０８３　０，０６４　０．０５６　０．０８１　０，０５７　照　２．２２　２．０９３　１．９２３　１．８８４　１．６９９　１．３２４　０．９７９　０．６１８　０．３５ｌ　０．２ｌ６　０．１５７　０．０９７　２．１０５２．１３６２．１１８　１．８９６　１．６３８　１．３２３　０，９５７　０．６０３　０．３６２　０，２２５　０．１４７　０．０９４　２．０９２　２．１６　２．１２６　１．８４８　１．６６ｌ　１．２９９　０．９１６　０．５８７　０．３５２　０．２１　１　０．１２９　０．０８８　平　均２．１３９２．１３０２．０５６　ｌ　８７６　１．６６６　ｌ＿３１５　０．９５４　０．６０３　０．３５５　０．２１７　０．１４４　０．０９３　值　阴　筹０．２９７０．１６８０．１４２０．０７８０．０６１　０．０５３　０．０４９　０．０４８　０．０４９　０．０１７　０．０４９　０．０５４　照　２．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定　将制备的ＧＳＴ—ＡｃｃＭＲＪＰ７多抗与意蜂王浆蛋　白样品和中蜂主要王浆蛋白基因Ａｃｃｍｒｊｐ５的真核　表达产物进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析，结果显示该多克　隆抗体能识别意蜂王浆蛋白样品中多种主要王浆　蛋白．而且能与在真核系统中表达的ＡｃｃＭＲＪＰ５蛋　白特异性结合，但不与２对照发生免疫反应，如图　３Ｂ所示　３讨论　鉴于蜂王浆组成的复杂性，长期以来研究者都　是从其整体水平上进行功能研究。随着社会发展和　生活水平的不断提高，人们对农产品已从数量追求　转变为质量和特色的追求，开始注重高品质、纯天　然的健康生活。蜂王浆无论是作为一种保健品，还　是被视为优秀的生物学实验材料，都具有重要的研　究价值．而主要王浆蛋白ＭＩＬｌＰｓ作为王浆最主要的　组分．其研究显得尤为重要。　目前．西方蜜蜂主要王浆蛋白是研究热点，东　方蜜蜂和西方蜜蜂的王浆成分不同　阍，深入开展东　方蜜蜂主要王浆蛋白的相关研究非常必要，中华蜜　蜂作为东方蜜蜂种下最重要的１个亚种，其主要王　浆蛋白的研究具有重要的科学伤值，已有的有关中　Ａ　Ｂ　图３　ＡｃｃＭＲＪＰ７多克隆抗体与意蜂王浆蛋白样品和　Ａｃｃｍｒｊｐ５基因真核表达产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ印迹分析　Ａ：意蜂王浆蛋白样品的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ图。Ｍ为标准蛋白分子量　Ｍａｒｋｅｒ，ＲＪ所示为意蜂王浆蛋白样品Ｂ：Ｗｅｓｔｅｎｒ　ｂｌｏｔ印迹分析。ｆｔＪ　所示为意蜂王浆蛋白，泳道１和２为对照，分别为正常粉纹夜蛾　（Ｔｒｌｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ，Ｔｎ）细胞抽提物和Ｔｎ细胞感染对照病毒后抽提物，　泳道３为Ｔｎ细胞感染Ａｃｃｍｒｊｐ５重组病毒后的表达产物（如箭头所　示）。ＡｍＭＲＪＰ：意大利蜜蜂（Ａｐｉ￣，　ｆｆ　ｒⅡ】主要王浆蛋白，不同ＭＲ　ａＰ　对应电泳条带标注根据Ｓｃｈｍｉｔｚｏｖａ等　：ＡｃｃＭＲａＰ：中华蜜蜂（Ａｐｉ￣　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ）主要王浆蛋白　Ｆｉｇ．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｏｙａｌ　ｉｅｉｌｙ　ｏｆ　Ａｐｉｓ，　ｆｆ　ｒａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　Ａｃｃｍｒ￣５　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｉｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉ—ＡｅｃＭＲＪＰ７　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａ：ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　ｏｆ　Ａｐｉｓ　ｍ＊ｌｌ￣ｒａ．Ｍ，ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｔ　ｆｔＪ，ｒｏｙａｌ　ｉｅｌｌｙ　ｏｆ　Ａｐ／ｓ，　胁屉ｒ（ｔ　Ｂ：Ｗｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｎａｔｉ—ＡｃｃＭＲａＰ７　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．　ＲＪ，ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　ｏｆＡｐｉｓ　ｍｆ　ｒａ；Ｉａｎｅｌ，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（Ｔｎ）ｃｅｌｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ；Ｉ．ａｎｅ２，ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｔｎ　ｃｅｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｂａｃｍｉｄ；Ｌａｎｅ３，　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｔｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｆｎｅｃｔｄｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｕｌｏｖｉｏｒｓ　ｃｏｎｔ￣ｎｉｎｇ　Ａｃｃｍｒｊｐ５　ｇｅｎｅ　蜂ＭＲＪＰｓ的研究仅仅是在个别基因的序列分析方　面的报道　８１．而未有与中蜂ＭＲＪＰｓ基因表达方面　相关的报道．且以往的表达和功能研究集中在蜂王　浆主要蛋白中含量最高的几种蛋白ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２　和ＭＲＪＰ３ｔ９　２Ｊ９／，而对一些含量偏低．不易被检测到　的蛋白，即使是在西方蜜蜂ＭＲＪＰｓ的功能研究中也　未见报道。Ｓｃｈｍｉｔｚｏｖａ等［６１通过对意蜂王浆进行　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分离后指出ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３ｓ和　ＭＲＪＰ５ｓ　４种主要王浆组分的相对含量分别为：　３１％、１６％、２６％和９％Ｉ１６，可见．其他组分的含量十分　有限，为了获取含量相对较少的蛋白组分．应用分　子生物学方法进行体外表达是一条重要途径　本研　究通过优化表达条件．在大肠杆菌中成功表达了中　蜂ＭＲＪＰ７基因，为ＭＲＪＰ７基因的功能研究打下了　基础。同时利用表达产物制备出ＭＲＩＰ多克隆抗体，　为多种ＭＲＪＰｓ研究和检测提供了材料。根据Ａｃ—　ｃＭＲＪＰ７蛋白序列在ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ搜索后发　现，ＡｃｃＭＲＪＰ７与意大利蜜蜂４种主要王浆蛋白　ＡｍＭＲＪＰ１、ＡｍＭＲＪＰ２、ＡｍＭＲＪＰ３和ＡｍＭＲＪＰ５的序　列相同性分别为６７％、７２％、６６％和７８％，与已报道　的ＡｃｃＭＲＪＰ５蛋白序列【　８１的同源性为７３％．本文中　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　李艳．等：中华蜜蜂ＭＲＪＦ７基因的原核表达及多克隆抗体的制备　１１３　图３的Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果也说明ＭＲＪＰ７多克隆抗体　可以检测多种ＭＲＪＰｓ。证明它们之间存在较高的同　源性。　蜜蜂基因组的全序列已经公布。之后蜜蜂基因　功能及王浆蛋白功能的研究必将成为热点。由于蜂　王浆主要蛋白家族所包含的王浆蛋白种类比较多．　给研究工作带来了一定的挑战。接下来对Ｍ　Ｐｓ功　能方面的研究还需要做大量的工作。　ＡｃｃＭＲＪＰ７是一种在王浆蛋白中含量很低的蛋　白。对其蛋白的成功表达和抗备．有助于开展　Ｍ　Ｐ７独特功能的研究。但本研究也同时说明。在　大肠肝菌中表达的蛋白为不溶性的包涵体蛋白．直　接用于进行蛋白性质和生物学功能研究有难度。为　此我们正在对该基因进行真核表达研究。另外，本　研究制备的ＡｃｃＭＲＪＰ７多克隆抗体对意蜂王浆的　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测表明。Ｍ　Ｐ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３ｓ和　ＭＲＪＰ５等王浆蛋白．由于同源性很高．有很强的交　叉反应．因此如果要深入检测和研究单个基因产物　的特性．制各能够区别不同Ｍ　Ｐｓ的特异性强的单　克隆抗体是必要的。　参考文献：　【１】Ｌｅｎｓｋｙ　Ｙ，Ｒａｋｏｖｅｒ　Ｙ．Ｓｅｐａｒａｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｏｄｙ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｏｒｋｅｒ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ（ａｐ／￣，础ＺＺ　ｒａ　Ｌ．）【Ｊ］．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８３，７５（４）：６０７－６１５．　【２】Ｋｎｅｃｈｔ　Ｄ，Ｋａａｔｚ　Ｈ　Ｈ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｌａｒｖａｌ　ｆｏｏｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ａｎｄｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｗｏｒｋｅｒ　ｈｏｎｅｙ　ｂｅｅｓ［Ｊ】．　Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ，１９９０，２１（５）：４５７＿４６８．　【３】Ｂｍｕｗｅｒｓ　Ｅ　Ｗ　Ｍ，Ｅｂｅｒｔ　Ｒ，Ｂｅｅｔｓｍａ　Ｊ．Ｂｅｈａｖｉｏｒｌａ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｎｕｒｓｅ　ｂｅｅｓ　ｉｎ　ｍｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｒｖａｅ　ｆｏｏｄ　ｄｕｎｎｇ　ｃａｓｔｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ［Ｊ１．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｉｃｕｈｕｒｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，　２６（１）：１　１－２３．　［４】Ｔｏｍｏｄａ　Ｇ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ　Ｊ，Ｍａｔｓｕｋａ　Ｍ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ．２．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｓｅｌ　Ｆｄ￣ａｆｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｓｃ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ【Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，　１６：１２５－１３０．　［５】Ｔａｋｅｎａｋａ　Ｔ，Ｅｃｈｉｇｏ　Ｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　【Ｊ］．Ｎｉｐｐｏｎ　Ｎｏｇｅｌｋａｇａｋｕ　Ｋａｉｓｈｉ，１９８３，５７：１２０３—１２０９．　【６】Ｓｃｈｍｉ￣ｏｖａ　Ｊ，Ｋｌａｕｄｉｎｙ　Ｊ，Ａｌｂｅｒｔ　Ｓ．Ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｍａｊｏｒ　ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆｔｈｅ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ　Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｆｉｅｒａ　Ｌ【Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，５４：１０２０—１０３０．　［７７］　Ｇｏｒｄｏｎ　ＦＴ，ＣｏＵｎ　Ａ　Ｌ．Ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｎａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒｏｙａｌｊｅｌｌｙ　【Ｊ］．Ｂｉｃｏｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９４０，３４（８－９）：１　１５５—１　１６２．　［８８］　Ｄｒａｐｅａｕ　Ｍ　Ｄ，Ａｌｂｅｒｔ　Ｓ，ｅｔ　１ａ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅｌｌｏｗ／Ｍａｊｏｒ　Ｒｏｙａｌ　ＪｅＵｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｏｃｉａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｉｎ　ｈｏｎｅｙ　ｂｅｅｓ【Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１６（１　１）：　１３８５－１３９４．　［９］１ｗａｏ　Ｏ，Ｙｏｓｈｉｆｕｍｉ　Ｔ，ｅｔ　１ａ．Ｍａｊｏｒ　ｒｏｙａｌｊｅｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｏｐｎｓｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｎ　ｖｉｖｏ【Ｊ］．　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，７３（１６）：２０２９—２０４５．　【１０】Ｋｕｃｈａｒｓｋｉ　Ｒ，Ｍａｌｅｓｚｋａ　Ｒ，Ｈａｙｗａｒｄ　Ｄ　Ｃ，ｅｔ　１ａ．Ａ　ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｓｕｂｓｅｔ　ｏｆ　Ｋｅｎｙｏｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｈｔｅ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｈｏｎｅｙ　ｂｅｅ　ｂｒａｉｎ【Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，１９９８，８５（７）：３４３—３４６．　【１　１】Ａｌｂｅｒｔ　Ｓ，Ｋｌａｕｄｉｎｙ　Ｊ，Ｓｉｍｕｔｈ　Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＲＪＰ３，ｈｉｇｈｌｙ　ｏｐｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ（ａｐ／￣　，础　ｒａ）ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ【Ｊ］．Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，２９（５）：４２７－４３４．　【１２】Ｓｉｍｕｔｈ　Ｊ．Ｓｏｍｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ　（ａｐ／￣胱ｚ　ｒａ）ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ，２００１，３２：６９—８Ｏ．　【１３】邢丽苹，沈立荣，鸟晓云，等．中华蜜蜂王浆多肽Ａｐ￣ｉｍｉｎ　基因转录、克隆与表达研究【Ｊ］．上海交通大学学报（农业　科学版），２００６，２４（５）：４６Ｏ＿４６４．　【１４】Ｔａｋｅｎａｋａ　Ｔ，Ｔａｋｅｎａｋａ　Ｙ．Ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　ｆｒｏｍ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　ｎａｄ　Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｆｉｅｒａ【Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｉｃｏｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，６Ｏ（３）：５１８－５２０．　［１５】Ｐｏｔｈｉｅｈｏｔ　Ｓ，Ｗｏｎｇｓｉｉｒ　Ｓ．Ａｔｔｅｍｐｔｓ　ｉｎ　ｑｕｅｅｎ　ｒｅａｒｉｎｇ　ｏｆ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａｌａｒｖａｅ　ｉｎＡｐｉｓ，础观　ｒａ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ａｎｄＡｐｉｓ￣ｕｉｆｅｒａ　ｌａｒｖａｅ　ｉｎ　Ａｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ【Ｊ］．Ａｓｉａｎ　Ａｐｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９９３，　１２８－１３３．　【１６】苏松坤，陈盛禄，钟伯雄，等冲华蜜蜂ｍ咖１　ｃＤＮＡ的克　隆及其序列分析【Ｊ］．遗传学报，２００４，３１（１１）：１２４８—１２５３．　【１７】苏松坤，陈盛禄，钟伯雄，等．中华蜜蜂ｍ咖３　ｃＤＮＡ的克　隆及序列分析叽冲国农业科学，２００５，３８（３）：６１２—６１８．　【１８】Ｓｕ　Ｓ　Ａｌｂｅｒｔ　Ｓ，Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｌ＇ｅｔ　１ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　ｎａｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｆｏｕｒ　ｃＤＮＡｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｈｅａｄｓ　ｏｆＡｐｉｓ　ｃｅｒａｎａ　ｃｅｒａｎａ　ｎｕｒｓｅ　ｈｏｎｅｙｂｅｅｓ　ｃｄｏｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍａｊｏｒ　ｒｏｙａｌ　ｊｅｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ【Ｊ］．　Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ，２００５，３６：３８９－４０１．　【１９】Ｉｍｊｏｎｇｊｉｒａｋ　Ｃ，Ｋｌｉｎｂｕｎｇａ　Ｓ，Ｓｉｔｔｉｐｒｎａｅｅｄ　Ｓ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍａｊｏｒ　ｒｏｙａｌｊｅｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ａｎｄ　２　ｏｆｔｈｅ　ｈｏｎｅｙ　ｂｅｅ　ｐ　ｃｅｒａｎａ）［￣．Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｂｉｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｎａｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２００５．３８（１）：４９—５７．