动物学报54(6):1005—1013,2008 Acta Zoologica Sinica 基于线粒体Cyt b基因部分序列的中国东方蜜蜂 不同地理种群的系统发育* 高鹏飞 赵慧婷 张春香 姜玉锁 山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801 摘要从线粒体DNA水平上对中国境内东方蜜蜂不同地理种群的系统发育进行研究,为保护和合理利用这一 宝贵的蜂种资源提供理论基础。对我国1O个省市的21群东方蜜蜂mtDNA Cyt b基因片段进行了扩增、测序,并 以意大利蜂、卡尼鄂拉蜂、印尼蜂作为外群进行序列分析。采用Minimum.Spanning Network方法构建系统进化树。 结果显示:扩增片段长度429 bp;在得到的21条同源序列中,共检测出13个变异位点,其中转换数为9,颠换 数为4,并且变异位点大都发生在密码子的第三位,无碱基插入或缺失;聚类分析结果显示西方蜜蜂、印尼蜂和 东方蜜蜂各为的蜂种;在中国东方蜜蜂群体中,吉林、海南和云南的东方蜜蜂各为一个的类群,其它 地区的东方蜜蜂为一个类群[动物学报54(6):1005—1013,2008]。 关键词 蜜蜂 东方蜜蜂 遗传多样性 mtDNA细胞色素b Minimunl—Spanning Network Phylogeny of different geographic populations Ap/s cerana in China based on mtDNA cytochrome b gene sequences GAO Peng—Fei,ZHA0 Hui—Ting,ZHANG Chun—Xiang,JIANG Yu—Suo College of Animal Science and Technology,Shanxi Agriculture University,Taigu 030801,Shanxi,China Abstract In order t《 provide the basic datum to protect and rationally develop the却 cerana resources in China,phylogeny of different geographic populations却 cerana in China was studied based on mtDNA Cytochrome b gene sequences.In this study, the partial sequences of mtDNA Cytochrome b gene of 21 colonies of却/s cerana collected from 10 provinces and the homologous sequences of却 nigrocincta and却 mettf ̄era downloaded from GenBank were analyzed.Molecular phylogenetic trees were reconstructed by minimum—spanning network methods.The multiple sequence alignment was performed using special software.The results indicated that the len ̄h of PCR products was 429 bp.Among the 21 analyzed sequences there were 13 variable sites,of which 9 sites were transitions,4 were transversions and there were no deletions or insertions in the sequences.Phylogenetic analysis based on the mtDNA Cyt b gene of 21 colonies of Apis cerana and the homologous sequences of outgroups indicated that the groups of却 nigrocineta,却 mellfiera and Ap/s cerana were clustered respectively.Jilin,Hainan and Yunnan groups of Apis cerana separated from the others in China【Acta Zoologica Sinica 54(6):1005—1013,2008j. Key words Honeybee,Apis cerana,Genetic diversity,mtDNA,Cytochrome b,Minimum-Spanning Network 东方蜜蜂(Apis cerana F.)广泛分布于亚洲, 从阿富汗到中国,从日本到印尼南部(Ruttner, 种间竞争上处于劣势,加之数十年来自然生态条件 的恶化,我国东方蜜蜂的分布范围不断缩小,部分 1978)。我国境内的东方蜜蜂分布于除、内蒙 古北部外的全国各省、自治区,是原有蜂种中分布 地区面临濒危的境地。深入了解我国境内东方蜜蜂 的系统发育关系,对于保护和合理开发利用这一宝 贵的蜂种资源具有十分重要的意义。 业已证明,线粒体DNA是研究蜜蜂系统发育 范围最广、经济价值最高的蜂种。然而,自上世纪 初西方蜜蜂(A. ZZ ra L.)引进以来,由于在 2008.06.O1收稿,2008.10—10接受 *山西省留办基金项目(No.2003051),山西省教育厅开发项目(No.200337)资助[This research were funded by the grants from the Foundation of the International Studies Ofice of fShanxi Province(No.2003051)and the Education Department of Shanxi Province(No.200337)] **通讯作者(Corresponding author) E-mail:jiangys.001@163.ecru ⑥2008动物学报Acta Zoologica Sinica 1006 动 物 学 报 54卷 的重要工具,在西方蜜蜂的遗传多样性和亚群体分 化方面得到了广泛的应用(Moritz et a1.,1994; Garnery et a1.,1995;De la Rtia et a1.,1998;Bouga 水平乃至科水平的系统发育信息,因而近年来已被 广泛应用于昆虫的系统学研究。目前己对膜翅目 (Collins and Gardner,2001;Parker and Kissing,2002; et a1.,2005)。研究方法从最初的探测蜜蜂样本的 Thompson and Oidroyd,2004)、直翅目(任竹梅等, 2002;Ren et a1.,2004)、双翅目(Kastanis et a1., 整个线粒体基因组的性酶切位点,到PCR扩 增线粒体基因组的片段,用性酶切位点或序列 探寻变异。通过对整个线粒体DNA的性酶切 2003;Dusfour et a1.,2004)、鞘翅目(黄菲,2004; Hughes and Vogler,2004)、鳞翅目(Torres et a1., 分析,首次对东方蜜蜂线粒体DNA变异进行的研 究表明,东方蜜蜂分为三种类型:亚洲型(样 2001;吴冬霞等,2007)、同翅目(Aikhionbare and Mayo,2000)、半翅目(Pfeiler et a1.,2006;代金 本来自日本、泰国、马来西亚、婆罗洲和南印度)、 吕宋岛型和安达曼群岛型(Smith,1991)。随后的 研究多集中在线粒体DNA tRNA “.COIl基因区(包 括tRNA 基因部分、非编码区完全序列和COIl基 因5 端)。采用10种性酶对东方蜜蜂的 mtDNAtRNAL ̄u_COIl基因进行RFLP分析,可将其分 为日本类群,尼泊尔一越南一泰国北、中部类群, 韩国一对马岛类群,中国类群,泰国南部类群 和菲律宾类群(Deowanish et a1.,1996)。采用:{E编 码区序列比较,可以将东方蜜蜂分为:亚洲型 (样本来自印度、尼泊尔、北部泰国、中国、 韩国和日本);Sundaland型(样本来自Samui岛、 马来亚半岛、爪哇、巴厘、龙日岛、弗洛勒斯岛和 帝汶岛);巴拉望型;吕宋一棉兰老岛型(Smith and Hagen,1996,1999;Smith et a1.,2000)。对菲 律宾的三个大岛和米沙鄢群岛巾的4个小岛的东方 蜜蜂线粒体DNAtRNAj ̄"-COII基因的PCR产物的限 制性酶切分析和序列比较,共检测到4个单倍型 (Cel、Ce2、Ce3和Ce4),其中Cel出现在棉兰老 岛和米沙鄢群岛,Ce2限于吕宋岛,Ce3和Ce4仅 出现在巴拉望(De la R6a et a1.,2000)。对中国境 内不同地理型东方蜜蜂线粒体DNAtRNA .COII基 因多态性和核DNA的AFLP分析,首次从分子水平 上证明了海南东方蜜蜂为东方蜜蜂的一个新亚种 (姜玉锁等,2007a,2007b)。此外,通过对泰国境 内东方蜜蜂线粒体DNA COl—COII、SSH rRNA、lsu rRNA和ATPase6 ATPase8基因的PCR产物进行的限 制性酶切分析表明,泰国东方蜜蜂可分为北部、半 岛和Samui岛三个种群(Sihanuntavong et a1.,1999; Sittipraneed et a1.,2001;Songram et a1.,2006)。 细胞色素b(cytochrome 6,简称 6)是线粒 体氧化呼吸链的重要成员,其基因的结构和功能在 mtDNA的13个蛋白质编码基因中被了解地最清楚, 且进化速度适中,较短的一个片段就能包含从种下 霞,2005)、原尾目(Shao et a1.,2000)、蜻蜓目 (Simmons and Welter,2001;张大治,2005)等部分 昆虫类群进行了研究。但有关东方蜜蜂Cyt b基因 序列及分子系统学的研究报道尚属空白。 本研究对来自中国境内10个省市15个采样点 (见表1)的21群东方蜜蜂线粒体DNA细胞色素b 基因部分编码区进行序列分析,并以意大利蜂 (A.mdt ̄fera ligustica)、卡尼鄂拉蜂(A.matVera carnica)和印尼蜂(Apis nigrocincta)作外群,构建 分子系统树,以期从分子水平上获得东方蜜蜂种群 问的相互关系,并为其系统发育的研究与利用提供 基础数据。 1材料和方法 1.1材料来源 本试验所用样本采白全国10个省市地区,共 2l群东方蜜蜂(2003.3—2004.10),除福建、江西 和北京的样本取自人工饲养的标准蜂箱外,其他均 为传统饲养法饲养的自然蜂群。在每个点分别采3 —5群蜂,每群随机采50—100只,放人无水乙醇 (分析醇)中,置一20 ̄C的冰箱保存至DNA提取。 1.2基因组DNA提取 采用常规的酚一氯仿抽提法,从每群蜂中分别 随机取出1只工蜂个体,取其胸部肌肉,提取每只 个体的基因组DNA,采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳 检测各模板有无降解;紫外分光光度计检测DNA 浓度和纯度,一20℃保存备用。 1.3 Cyt b目的基因片段的PCR扩增 参照GenBank上公布的东方蜜蜂线粒体DNA b的序列(登录号:AF059347),用Pfime ̄.0 设计引物,上游引物为:5 一TGAGGTGCAACAGTA. A I AcAAA一3 ;下游弓I物为:5 一TGC ITAcTCAAT. TrTACGGTGC一3 ,引物由北京奥科生物技术有限公 司合成 6期 高鹏飞等:基于线粒体crt b基因部分序列的中国东方蜜蜂不同地理种群的系统发育 1007 表1用于线粒体分析的蜜蜂样本 Table 1 Honeybee samples for the mtDNA Cyt analysis 1.4 PCR产物纯化、测序 PCR产物电泳割胶回收,用凝胶纯化试剂盒 (上海华申能)进行纯化,将其中21份样品委托北 京奥科生物技术有限公司采用正反链双向测序,测 海南东蜂 HNHK 海南海口 序仪为ABI PRISM 3730型。眦 一 一 一 l耋 脚A.cer ̄izo,in Hainan Haikou Hainan 广东东蜂 广东广州 GDGZ A. ̄el'aD,a in Guangdong Guangzhou Guangdong 福建东蜂 福建福卅『 A.Cel'O,D,O,in Fujian Fuzhou Fujian 云南东蜂1 云南西双版纳 A.ce,0n0 in Yunrlarl Xishuangbanna Yunnan 云南东蜂2 云南保山 A.cel'o,na in Yunnail Baoshan YLlrlnarl 江西东蜂 江西南昌 A.ceratzo,in Jiangxi Nanchang Jiangxi 四川东蜂 四川宜宾 A.ceg'o,na in Siehuan Yibin Sichuan 甘肃东蜂 甘肃天水 A.cero,m in Gansu Tianshui Gansu 山西东蜂1 山西沁水 A.cer ̄L ̄o,in Shanxi Qinshui Shanxi 山西东蜂2 山西沁源 A.cel'o,Irla, in Shanxi Qinyuan Shanxi 山西东蜂3 山西左权 A.CeI'O,IZO,in Shanxi Zuoquan Shanxi 北京东蜂 北京房山 A.cel'o,n ̄in Beijing Fangshan Beijing 吉林东蜂1 吉林桦甸 A.cet' ̄1iza in.1ilin Huadian Jilin 吉林东蜂2 吉林安图 A. ̄el'ano,in Jilin Antu Jilin 吉林东蜂3 吉林辉南 A.ceranct in Jilin Huinan Jilin 每一样品的反应总体系为50肚l:其中模板 DNA(50 ng/t ̄1)1.6 l,10×buffer 5 l(含Mg2 ), dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTrP各2.5 mmol/L)4 肚l,上游引物(10 t ̄mol/L)1.6 tA,下游引物(10  ̄mol/L)1.6 l,Taq DNA聚合酶(2.5 U/t-d)0.5 l,灭菌三蒸水35.7 l。扩增条件为:95℃预变性 5 rain,然后95℃变性30 s,56 oC复性1 rain,72 ̄C 延伸1 rain,32个循环,最后72 ̄C延伸10 rain。扩 增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.5序列分析 用Contig Express软件对测序结果进行正反链序 列的互补检测,并参考原始序列图进行人工核对、 校正,经过计算机和人工校正后,确定出无误的序 列。校正后的序列保存为Fasta格式。所有的序列 再一起用MEGA version 4.0软件(Tamura et a1., 2007)中的Clustal 排序,生成供系统发育分析 的矩阵,用MEGA version 4.0软件计算遗传距离, 分析序列的碱基组成、差异百分比及变异位点数。 系统树的构建采用Minimum—Spanning Network方法, 通过TCS软件(Clement et a1.,2000)进行聚类分 析。 2结 果 2.1 PCR扩增结果 21群东方蜜蜂的总DNA PCR产物用1.0%的 琼脂糖凝胶电泳检测,以DL2000为分子量标准, 得到了约400 bp的扩增产物(包括引物长度),带 型清晰明亮且无杂带,经重复试验后,稳定性良 好,电泳检测结果如图1。 2.2序列组成与特征分析 测序结果经正反链拼接校对后,21个东方蜜 蜂的序列长度均为429 bp,无碱基的插入或缺失。 按照采样点不同,向NCBI网站提交序列,序列登 录号为:EF180090一EF180095、EF467437、FJ229471 一 FJ229473、 FJ229475、 FJ229476、 FJ229478 一 FJ229480。拼接后的序列经C]ustal IV排序,并用 MEGA version 4.0转换格式后,计算各序列的碱基 组成,所得到的21个东方蜜蜂cyt 6基因部分片段 中A、T、c和G碱基平均含量分别为33.0%、 44.0%、13.8%和9.2%,其中A+T的含量为 77%,明显高于G+c含量23%。就每个氨基酸密 码子来看,碱基组成在不同位点差异较大。第三位 点A+T平均含量最高,达93%,第一位点和第二 位点A+T含量差别不大,分别为69.9%和 67.9%,另外,第三位密码子T碱基使用频率特别 高(51.5%),而G碱基使用频率很少(9.2%), 反应出cyt 6基因在密码子的使用上具有偏好性 (表2)。 1008动物学报卷101OOObO0Ob75525●00bp0b0bpOObpppp图1.部分扩增产物的电泳检测结果EIectrOphoresFig1isresultsOfPCRprOductsf}OmpartiaIsanlples表2东方蜜蜂0f6基因部分序列不同密码子位点碱基频完全相同的。广东与吉林桦甸群体的序列差异最9,率(%)Tpa大Nuc,碱基差异数为。整体上看,各地区东方蜜蜂印尼蜂与东方蜜ble2leOtjdeofrequenciesofdifferentcOdonsitesfor碱基差异变化不大同源性较高35,。artiaJ(≯6genefAp括cP,甄阼口蜂平均碱基差异数小(32)49..与海南蜜蜂碱基差异数最。西方蜜蜂与东方蜜蜂平均碱基差异数52.83,与印尼蜂平均碱基差异数5。23系统发育树的构建选择西方蜜蜂的两个亚种意大利蜂(A∞m.脚Zfi居mz西Ms£icn)、卡尼鄂拉蜂(.以.脚Zf咖m,ic。)和印尼蜂(46n☆脚inc抛)作为外群与采21个东方蜜蜂咖Tcs部分序列进行多重比对后,,用软件包构建系统发育树,如图3。从聚类图中可以看出一每两个相邻点均代表有一选择西方蜜蜂的两个亚种意大利蜂(Acom.个突变位点产生,,没有突变的种群首先聚到。胱Zz派m妇删ic口)、卡尼鄂拉蜂(.A.榭ZZ咖m,起中间不出现连接东方蜜蜂。、印尼蜂和西方蜜ico)和印尼蜂(An堙rociw、纽)作为外群、序,蜂形成了明显的三大分支大致可构成221、个东方蜜蜂聚类后北京和山西左权的、列登录号分别为M87052EFl84046AFl81609,个聚类簇,江西与所测图2。21条东方蜜蜂序列进行同源比对条东方蜜蜂序列比对中va,结果见13东方蜜蜂组成原始蜂群;广东福建、四川、甘在21共检测到肃、山西沁源和山西沁水的东方蜜蜂构成了第1聚,个变异位点数(30%.riabIesites),占总位点数的。类簇聚在其中广东及山西沁水的东方蜜蜂又相对;,单碱基变异位点数为个转换()。4个鸭变异位点中包,各形成的分支一云南、海南和吉林的东方蜜蜂,括9nansition,)4个颠换,起,形成了聚类簇,II但海南和吉林的东方。(TransverSion‘,rv在429个碱基序列比对结果中蜜蜂又从中分出形成的分支印尼蜂与所测个,21条东方蜜蜂序列变异位点数为21413讨论15西方蜜蜂两个亚种与所测5东方蜜蜂序列平均变异位点数为21个本试验所得到的东方蜜蜂条伽6f查询西方蜜蜂c',个地理种群的,21。个东方蜜蜂序列与3,3个外群蜂序列两两问个东方蜜蜂跏,基因扩增序列长度均为29bp通过NcBI碱基差异见表为川表中显示0—216基的全基因序列发现427bp一,这一片段之问+,因片段的碱基差异为301。.9个不等平均碱基差异在c”6全序列中的位置处于855bp,其中,同一地区的两个东方蜜蜂群体的0。是相对靠后的一段序列,。在所有序列中23%,A+T平序列完全相同、,碱基差异数为,另外,福建与四、均含量为明显高于A+77%G+c。为表现出AT含量,甘肃、山西沁源群体间江西与山西左权北G+c含量,与其它科目的昆虫相比71%其京群体间,吉林安图与辉南群体间的碱基序列也是T含量偏高如直翅目山稻蝗为(任竹梅6期高鹏飞等:基于线粒体c如6基因部分序列的中国东方蜜蜂不同地理种群的系统发育1009i■;;;!;:j!ii;!i;i;;;;:;jj一f;;;;;i;;!ii;ii;;;!;i!:;;}.uuu.。......。..。.。.....Ⅲd昌::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::昌::::::::::::::::::::&g譬曼:::::::::::::::::::::jHj::EP:::::::::::::::::::::¨q8::::::::::::::::::::'鼍j芦::::::::::::::::::::?…毒:::::::::::::::::::::::;:::::::::::::::::::::::■’‘‘。‘...........pq。‘p‘‘■..................■‘‘’‘’’。‘‘‘‘‘。q..........}ii;!!;;;ij!i:;i;!;!;::;;!;;!;;lj!;ii:i;;!;;!;:;;;《;;;;:;jjjiii;;!jij!;;;;;;:ij;!;!:;iii!;¥ij;;㈡;i;l!;!i;§i::!!:!::::::!:!:!!j;;j:ii;;;ji;:;i15:;;;;i;i;:!;;!;;;;:j;jjj::5;!;;;ii;;;;;;!j;!;;;::fj!;iiij;!;;!;!;i:;:;;:jiij;!;;i;!;;i!;;:;;i;!;;l;;i;;;;;;ii;!;:;:i:i::;l;j;ii;;;;;;;;;i;;!!;;}i;;:;!;;;ii;iii;!;;!;i;i!jij!;;!;;j!;:!;;i;!ij!l;ij;;;;;:;j;;!;;!ji;ijj};i;!:;;;;;j;i;!;!;;;:;;lii!;;;i;j!;;:;;!;;ij:;;i;;;;;;;;;;i;;;!;j!;;j!;j;i:;:!j!;;j:!;!;;;;;::i}!;;;;;;i;;;:;i;i!;;!jjj;;;;!ii;j;j;;;;;!;;;:i;;;ji;ii;::;i;!;i!j;i;;i;;};!i;:;;ji;j;;;j;i!;i!;;l;;;j!;!;;!;!;;;j!;:;;;;jjjijj!;;;;i;;!;!;;;;i;:!;!;;;;;;;!;;!i;_;;i;;;!;旺三二三二三三三二墨jjii!;;;;!;!;:j:;;!;j:ji:jl;;;!;;j;;;;;;:;;:;;!;;;;;i;;;ii;;;j!j;;;;;;;;i::;::j;;:!;;;:!;;:;;ijji;;;;;;;;;!;!!;;!i;;;;;;i;;!i;;;ij;;;;;;;;;;;ji;liii!;i;i;;i;j!;;:;;!;;!旺三二二二二三三三j;;:I;;;!;;;;i;;i;!j;;j;;!;;:ii;;;;!;;;ii:;::;!;;;;;!;:l;!!;;;i;;::!!;;;;;;:;;;旷■__—___—一l;:;ii;;;i;;;;;;;:;;;!;j目;jjjjjj:jjjjjjjjjj叫!jjl;!:;;:;;;;;;j!;i;!;!!;!;i!j!ii;!;j;;;j;;;;;;;!;ii;:;;;:;;i;;;;!;;!ii:;;i:i;i!;!;;!j;;;!!!;i;;;;}:!;!;!;;;ij::!;!i!;;!:;;i;;;;!iji;;!;;;;;::;;;;ij;!;;i;;;jj;!;;;;:;;;jj;!;:;i:;;;!;j!j;;:;;!;:iii;;;l:;!;;;;j!;;;;;!;!;;;i;;;iii;i;;;!;!;:;;!;jjj;;i!;!:;;:!!i;;::;;i!:!::盯——■■了呵———㈠;5;;:;!;j;:!j;;;:;j!;:ji;;:ji!i!;!;jij!;;;;;;ilj;i;;;!;jii;;ii!;!i;;;;;;;;;;!!;!:;;:;;;j;;;!jj;j;;;:;;;ji;;;;!ji!;;j!;:;;;;!;i;j;!j;!ij;!;;§i;;;;;ij:i!:;!j;ij;;j;;;i;5;;;!;:!;;j;;;:;;;;;;ijjEii;;;:::i;j;:j!;i;j!;;!l:!;;;;ji!;;!;;i;:;;;;;il;;;;!;i!:!;;;;i:;;;;;!;;i;;;;;;;;;!;;:::;;!j:ji;;!;;;;:《;j;;i;;!;;i;;::ijj;;!;j;;;;;;;;;;;;;;j!l!j;jji;;;;;i;i;i!;;;;;;j!;;;::!!;j!;;!:;i;;!;;;}i;i;;!!;!;;!;!;ji;;;!j;旺:iii:iiiiii!;i;i!■jjj;i!;jii;i;!;i;ji;ij;jjij;;;;;j;j!;;;;!ii;iij!j!;;;i;i!;:j:;l;;;;ji;i;;;;;;j;!;;;;jjij;;;i!;;;;;;i:;;;;;■jjiii;;!ii!iii;jjj睦;;i;ii;iiiiii;ii!■j;;i!;;;;;;;j;!!;!!;i;i!;;;;j;i;!;;;ii;!;;;;:;;;lj:;!;!j:j;;j;;;;j;;:;;il;;;;;;;;:!;:!ii!;j::;;ji!!:;;ij;!;:;i;;!;!;;;:i6z!;ij;;;i;;i;:;;;;;;;j;;;!l!!:;:;;!;;:;i;:::!;i!;!l!!;i:i;;j;j;;;;;;;dq;;唾迥昧制藤恤静杠3垂}由懈脚j!!—as∞。笛詈。目j;!ii;;;!;;;;;i;!;i;;jj!i;ij;:!;i;;;i!i;;;;i;;ii盱—罂■■■■『『『_3是了{,息导sⅡ名目IlI厶0d—u]争a蛊:一占舒辞一Id!;!lii!:;:;;ij;;j!;;;:i;j;;i!;;;;;:!;;;;;;;;;!j!;;;;;!i;:;ii;;ji;j;;!;;;j;i:!:!!!!:;i!:;:jjjij!;;;;;i!:;;;;j;;i;;:;;;;j;;!ij;;;!;;i;;j!;;ii!i;;;;:ijjj;i!i!;;;;i;;睦i!;iiiiiii;j;i!!;i!;i;ii;:卫jj!i:;;;i;:;;;:;;;:!!!::jjjj;;;;;;;;!i;i;:j;ii;ijjj}j:;!;;ii!ji!;ji;ji;!i;ji;;;;i;j!;i;j!ji;;iji;∈E;;;;;;;!i;!;;e!;;;;;;;::l;i!;;;;;;i;;;;j;!;;;:!;i!;;!;;;;;;;;j;j!!j;;!;;;;;;;:;;;;;;!ij:;!;;!;;:i!;;!;i;!;;;;;i;;!;;;ii!};;;ii;;;;!;!;;;;!;;;j!;;;;:i!;!j;i;;;§;:i!;:!j15j;;i;;;!!;:i;;;jj;ii;;;l:;!;;;;;;i:;!;:!;!j■;;!;;;j!jij:!j!ii;j!j;:j;;《!j!;:!;i;;!;;j;i;i:::i!i:::::!:!::i,jji;;::;;ei!;:;;;!jj!:j;;;;i;;ijjiiji;;iii;j;;;ji;i!;;!jjl;:;;;!:i;;!;;i!;;!;!;::;;:j;;;;j:;!;;;j;i;!jl;!!;j;i;;;;;;;ji:j!!;;;;!il!i;!i;;!i;;;i!;;;;jj!;;j;;}!;;i:i;!;;;l;;;j;!jij;!;:;;ji:;;!;;;;;;j;;;;}ji;;!;;;jij!;;;;;;ji;!j;j!;jj;!;;;;!;;jii;;;ijfji;j;;;:;5!;i;ij:;;!;!;;盯■—可可可可可可■田!;!ii!ji;;i;;;i!j!j;;j;;;!;l;i;;:j;!j;;::;;j;:j;;j!}:;:;!j;i::i!;;i;;;;;;:;。。;:;::;!;jii!i:i;;:;i;;;!ij!;j::i;j;:i:;i;!;:;j—i。懿i。羹》。塾N糕黼黼勰;熟l樊鞭鞣酬黼熬l樊㈧鞣戮瞧;㈣l婆茹曾1OlO 动 物 学 报 54卷 糕咻删郴筐盆 世迎避 譬. 0 【_ ∞ 卜_【 H _【 寸 磊 墨 2 lf N_【 Il .是譬嚣. 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