维普资讯 http://www.cqvip.com 江苏农业科学２００８年第４期 中华蜜蜂 一葡萄糖苷酶基因片段的克隆与序列分析 樊少华 ，张子峰 ，陆 军 ，吴冬梅 ，单群 ，胡 斌 ，郑元林 ，缪晓青 （１．徐州师范大学生命科学学院，江苏徐州２２１１１６；２．江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州２２１１１６； ３．东南大学基础医学院，江苏南京２１００００；４．福建农林大学蜂疗研究所，福建福州３５０００２） 摘要：以意大利蜜蜂ｏｄ一葡萄糖苷酶基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＮＭ＿００１０４０２５９）的保守区设计引物，从中华蜜蜂 （ ｃｅｒａｎａ ｃｅｒａｎａ）工蜂中提取总ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，进行ＲＴ—ＰＣＲ，将扩增产物克隆到ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ载体 上，导肠杆菌ＪＭ１０９，阳性克隆经双酶切鉴定后测序，将测序得到的中华蜜蜂 一葡萄糖苷酶（ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉ— ｄａｓｅ）基因与已知的意大利蜜蜂核苷酸序列比较，同源性为９１．３１％。氨基酸序列与意大利蜜蜂、黑腹果蝇、埃及 斑蚊、冈比亚按蚊、印度蜜蜂、小蜜蜂、非洲爪蟾、日本蜜蜂、赤拟谷盗、尖音库蚊的同源性分别为９０．８３％、 ４８．１１％、４７．２８％、４５．７４％、４２．２５％、４１．２１％、３８．１０％、３７．９３％、３５．５６％、３３．８８％。首次从中华蜜蜂工蜂中成功 扩增到长度为７４５ ｂｐ、编码 一葡萄糖苷酶（ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）的基因片段（已提交ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为 ＥＦ６３８８４２）。 关键词：中华蜜蜂； 一葡萄糖苷酶；基因克隆；序列分析 中图分类号：Ｑ５２３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３９２（２００８）０４—００６７—０３ 一天然淀粉是由两种不同的葡萄糖聚合物组成， 种是直链淀粉，另一种是支链淀粉。Ｏ／一淀粉酶 ｃｅｒａｎａ，简称中蜂）的 一葡萄糖苷酶研究尚未见报 道。本研究首次对中蜂 一葡萄糖苷酶基因进行克 隆、序列分析，以期为进一步研究中华蜜蜂分子生物 学奠定基础。 （ＥＣ ３．２．１．１）能够切开淀粉链的Ｏ／一１，４糖苷键， 将淀粉水解成单糖、低聚糖和糊精等长短不一的水 解产物¨Ｊ。在哺乳动物中，淀粉水解的单糖可以自 由通过肠壁上皮细胞，而淀粉的其他水解产物不能 被肠壁直接吸收，必须由粘膜二糖酶水解成单糖后 １材料与方法 １．１供试材料与试剂 才能被吸收利用，二糖酶是按照酶作用底物而命名 的一类消化酶，它包括ＯＬ一葡萄糖苷酶、ＯＬ一葡糖水 解酶等。ＯＬ一葡萄糖苷酶（ＯＬ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２． １．２０）又名麦芽糖酶、葡糖转化酶或葡糖甘蔗糖酶， 中华蜜蜂工蜂从福建农林大学蜂疗研究所中华 蜜蜂试验养蜂场采集；菌株ＪＭ１０９由本实验室保 存；Ｍ—ＭＬＶ逆转录酶、Ｔ４连接酶、ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ及Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ为 它在淀粉水解的最后步骤中起着重要作用，它可通 过水解Ｏｌ一１，４糖苷键从多糖的非还原端水解出Ｄ 一Ｐｒｏｍｅｇａ产品；ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ为ＱＩＡ— ＧＥＮ产品。 １．２ 方法 葡萄糖 Ｊ。从某些微生物、植物、动物中已经分 离纯化出ＯＬ一葡萄糖苷酶，并已测定出基本结 构 Ｊ。目前有关蜜蜂Ｏｌ一葡萄糖苷酶的研究仅限 １．２．１ ＰＣＲ引物设计 从ＧｅｎＢａｎｋ数据库获得 多个Ｏ／一葡萄糖苷酶基因，通过ＢＩＯＥＤＩＴ寻找保守 区，再利用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件，设计多对引物， 其中有１对引物获得了有效扩增，其上游引物序列 Ｐ１为：５ 一ＣＣＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＧ ＩＴＡＣＣＡＡ一３ 。下游 弓Ｉ物序歹Ｕ Ｐ２为：５ 一ＴＡＡＡＣＡＡＴＣＡＴＣ ＩＴＣＣＡＴＣ— 于意大利蜜蜂（却 ｍｅｌｌｆｉｅｒａ，简称意蜂）、印度蜜蜂 （却 ｃｅｒａｎａ ｉｎｄｉｃａ）、日本蜜蜂（和 ｃｅｒａｎａｊａｐｏｎｉｃａ） 和小蜜蜂（却 ｆｌｏｒｅａ），有关中华蜜蜂（却 ｃｅｒａｎａ 收稿日期：２００８一Ｏｌ一２９ 基金项目：江苏省属高校自然科学重大基础研究项目（编号：２００７）； 徐州师范大学重点科研基金（编号：０６ＸＬＡ１２）。 ＧＡＴ一３ ，引物由上海生工生物工程技术服务有限 公司（Ｓａｎｇｏｎ）合成。 １．２．２蜜蜂总ＲＮＡ提取１．２．３ 目的基因的扩增将中华蜜蜂活体工蜂进 用Ｍ—ＭＬＶ逆转录酶体 作者简介：樊少华（１９７７一），男，河北沧州人，硕士，讲师，研究方向 为酶学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｆｓｈｆｌｙ＠ｘｚｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 通讯作者：郑元林，博士，教授，研究方向为药理学。Ｔｅｌ：（０５１６） ８３５００３４８：Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｌｚｈｅｎｇ＠ｘｚｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 行冰浴匀浆，用Ｔｒｉｚｏｌ一步法抽提总ＲＮＡ。 系，将中华蜜蜂工蜂总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，然后 维普资讯 http://www.cqvip.com 江苏农业科学２００８年第４期 进行ＲＴ—ＰＣＲ扩增，５Ｏ ｌ反应体系中含有ｄＮＴＰｓ 各２００ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ，上下游引物各１０ ｐｍｏｌ，Ｔａｑ酶 （ＴａＫａＲａ公司）１．２５ Ｕ，模板２ ｔｘｌ，ｄｄＨ，Ｏ补足体积。 按２步ＰＣＲ程序进行ＰＣＲ扩增，具体程序如下：９５ ℃预变性３ ｒａｉｎ；９４℃３０ ｓ，４６℃１ ｒａｉｎ，７２℃１．５ ａｒｉｎ，３个循环；９４℃３０ ｓ，４８℃１ ｍｉｎ，７２℃１．５ ｍｉｎ，２个循环；９４℃３０ ｓ，５０℃１ ｒａｉｎ，７２℃１．５ ｍｉｎ，１５个循环；９４℃３０ ｓ，５２℃１ ｍｉｎ，７２℃１．５ ａｒｉｎ，１５个循环；循环结束后７２℃延伸１０ ｒａｉｎ。最 后进入４℃状态，扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳 进行鉴定。 １．２．４ ＲＴ—ＰＣＲ产物的克隆及测序 ＲＴ—ＰＣＲ 扩增产物经ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ纯化后，与 ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ连接，转化到ＪＭ１０９感受态细 胞中，在ＬＢ／Ａｍｐ／ＩＰＴＧ／Ｘ—ｇａｌ平板上筛选阳性克 隆，然后采用Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓ． ｔｅｒｎ抽提质粒，经Ｅｃｏ ＲＩ双酶切鉴定，筛选出重组克 隆。重组克隆由上海生工生物工程技术服务有限公 司（Ｓａｎｇｏｎ）进行ＤＮＡ测序。将所测的序列结果在 ＮＣＢＩ网站上通过Ｂｌａｓｔ ｎ和Ｂｌａｓｔ Ｐ进行序列的相似 性分析，最后用ＤＮＡＳｔａｒ５．０软件进行序列的比较 分析。 ２结果与分析 ２．１ ＲＴ—ＰＣＲ产袅匆 从中华蜜蜂工蜂中快速抽提总ＲＮＡ，将之反转 录成ｃＤＮＡ，进行ＲＴ—ＰＣＲ扩增，得到约７５０ ｂｐ的 特异性条带。经分析初步认为可能是所要克隆的目 的基因片段。 ２．２重组质粒酶切鉴定 从平板上挑５个白色菌落，摇菌后提质粒经电 泳初筛发现全部为阳性。选择其中１个阳性质粒进 行双酶切，凝胶电泳显示，观察到２条片段，其中１ 条约７５０ ｂｐ，表明成功地构建了含中华蜜蜂工蜂ｏｔ 一葡萄糖苷酶基因片段的重组质粒（图１）。 ２．３测序结果与对比分析 测序及其序列分析结果表明，所克隆到的中华 蜜蜂 一葡萄糖苷酶基因片段的ｃＤＮＡ序列长度为 ７４５ ｂｐ，编码２４０个氨基酸（图２）。克隆所得序列 已提交ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为：ＥＦ６３８８４２。所得基因片 段核苷酸序列与意大利蜜蜂（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＮＭ＿Ｏ０１０４０２５９）相比较，同源性为９１．３１％，编码区 ６５个碱基位点发生了变化，导致了２２个氨基酸的 Ｍ ２ ０００ １ ０００ ７５０ ５００ ２５０ ｌＯＯ Ｍ：Ｉ）ＮＡ ｍａｒｋｅｒ 图１含中华蜜蜂工蜂ｃ【一葡萄糖苷酶基因 片段的重组质粒电泳图 差异。将翻译的氨基酸序列进行同源性比对（表 １），结果显示，中华蜜蜂 一葡萄糖苷酶基因片段的 氨基酸与意大利蜜蜂（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、黑腹果蝇 （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、埃及斑蚊（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐ— ｔｉ）、冈比亚按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）、印度蜜蜂（和 ｃｅｒａｎａ ｉｎｄｉｃａ）、小蜜蜂（Ａｐｉｓｆｌｏｒｅａ）、非洲爪蟾（Ｘｅｎｏ． ｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、日本蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒａｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、赤拟谷 盗（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、尖音库蚊（Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ） 的同源性分别为９０．８３％、４８．１１％、４７．２８％、 ４５。７４％ ４２．２５ ４１。２１ ３８．１０％、３７．９３％ ３５．５６％、３３．８８％ ￡盆显△出 Ｑ垃 ￡皿 ＴＴＯＧＧＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＯＴ Ｐ Ｎ Ｇ Ｓ Ｖ Ａ Ｎ Ｖ Ｓ Ｇ Ｎ Ｈ Ｄ Ｈ Ｈ Ｒ ０ＴＣ１０ＣＣＴＣ０Ａ０ＡｒｒＣ０ＧＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＡＡＴＧ ＣＴ０ＡＣ０ Ｖ Ａ Ｓ Ｒ Ｆ Ｇ Ｒ ０ Ｒ Ａ Ｄ Ｅ Ｉ Ｌ Ｍ Ｌ Ｔ ＴＴ０ＡＣＴＴＴ０ＣＣＣＧＯＣＡＴＡＯＯＯＧＴＴ０１ＴＴＡＣＡＡＴＯＧＧＧＡＣ０Ａ０ＡＴＣＯＧＧＡＴＧ Ｌ Ｔ Ｌ Ｐ Ｇ Ｉ Ｇ ｖ Ｖ Ｙ Ｇ Ｄ Ｅ Ｉ Ｇ Ｈ ０Ａ００ＡＣＡＧＧＣＣＯＴＴＣＡＣ０１ＡＣＯＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＡＧＡＣＣＣＧｏＣＣ００Ｔ Ｔ０ＣＡＡＣ Ｅ Ｄ Ｒ Ｐ Ｆ １ Ｙ ＾ Ｅ Ｔ Ｖ Ｄ Ｐ ＾ Ｇ Ｃ Ｎ ＯＣＣＧＯＣＣＣＣＯＣＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣ邢ＡＡＡＴＣＣＡｏＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＡＣｒＯＡＣＧＣＣＣ ＾ Ｇ Ｐ Ａ Ｋ Ｙ Ｙ ｌ Ｋ Ｓ Ｒ Ｄ Ｐ Ｅ Ｒ Ｔ Ｐ ＴＡＴＣＡＡ１Ｂ００ＡＣＡＡＣＡ０ＣＡＣＧＡＯＣＯＣＴＧＧＡ ＴＴＣＴＣＣＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＡＣＴ Ｙ ｑ Ｗ Ｄ Ｎ Ｓ Ｔ Ｓ ＾ Ｇ Ｆ Ｓ Ｄ Ｒ Ｎ Ｋ Ｔ ＴｏＧＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＡＡＴＴＡＣＡ０ＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴ０ＣＣ０ＣＴＣＡＡＡＡ０ Ｌ Ｐ Ｖ Ｎ Ｄ Ｎ Ｙ Ｒ Ｓ Ｌ Ｎ ｌ ＾ Ａ ０ Ｋ ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＣＡＴＴＡＣＧＴＯｏＣＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＡＴＣＴＧＡＡＧ ＡＡＧ Ｋ Ｅ Ｙ Ｙ Ｓ Ｈ Ｙ Ｖ ＾ Ｆ Ｋ Ｓ Ｍ Ｓ Ｙ Ｌ Ｋ Ｋ ＣＡＧＣＣＡ０Ｔ０ＡＴＣ０ＣＧＡＡＣｏＧｏＡ０ｃＴＴ００Ａ００Ｔ００ＡＣ０Ｔ０ＡＴＣＧＡＴＯＧＡＡＡＧ ｑ Ｐ Ｙ Ｉ ＾ Ｋ Ｇ Ｓ Ｌ Ｅ Ｙ Ｄ Ｖ １ Ｄ Ｇ Ｋ ０ＴＴＣＴ０Ａ０ＣＧＴＯＡＡＡＣＯＧＡＡＡ ＣＴＣＧＧＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＯＩ＂ＯＡＴＡ０ＴＴＡＴＯＧＴＡ Ｖ Ｌ Ｓ Ｖ Ｋ Ｒ Ｋ Ｌ ６ Ｄ Ｔ Ｖ ｌ Ｙ Ｖ Ａ＾Ｔ ＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡ＾ＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣ Ｎ Ｆ Ｓ Ｋ Ｎ Ｐ Ｖ Ｔ ＩＮ Ｍ Ｓ Ｔ Ｌ Ｈ Ｐ Ｐ Ａ ０ＡＴＣＴＣＧＴＣＧ代ＴＡｃＧＣＯＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＴＣＣ，ＧＣＴＣＣＣＯＴＣＴＴＡ０ＣＣＡＣＧＧＣ Ｄ Ｌ Ｖ Ｖ Ｙ Ａ Ｎ Ｖ Ｉ Ｇ Ｓ ６ Ｌ Ｓ Ｈ Ｇ ＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＴＣＣＣＣＧｏｃ ＣＴＡＡＣＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴ．【℃ Ｎ Ｉ Ｙ Ｐ Ｔ Ｓ Ｍ Ｔ Ｉ Ｐ Ｇ Ｓ Ｎ Ｓ Ａ Ｉ Ｆ ＡＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＡＴＴ０ＴＡＴＴＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＧ ＣＡＡＧＧＴＧＴＡＧＡＴＴＯＧ ＴＴＧ ＴＡＧＡＴＴ Ｔ Ｎ Ｙ Ｋ Ｌ Ｙ ｗ Ｒ Ｙ ｗ ｑ Ｇ ｖ １３ ｗ Ｌ 注：加下画线的为引物序列，核酸序列总长为７４５ ｂｐ， 编码２４０个氨基酸残基 图２中华蜜蜂ａ．葡萄糖苷酶基因片段核苷酸序列 及相应的氨基酸序列 ３讨论 中华蜜蜂属东方蜜蜂种下的主要亚种，是我国 特有的蜜蜂资源，长期适应于我国的地理特征和气 候条件，具有极好的抗寒能力和耐热能力。比意大 利蜜蜂具有更低的耐受温度，对山区零星蜜粉源的 利用能力特别强，在早春的果蔬授粉中有很高的优 维普资讯 http://www.cqvip.com 樊少华等：中华蜜蜂Ｏ／一葡萄糖苷酶基因片段的克隆与序列分析 一６９一 表１ 中华蜜蜂目的基因克隆片段与其他物种 一葡萄糖苷酶 苷酶基因片段，为进一步克隆该基因全长序列、进而 基因片段核苷酸序列相应的氨基酸序列同源性比对 从分子生物学水平研究中华蜜蜂有关疾病如乳糖或 氨搬登录号 物 种 氨基 源性 蔗糖利用障碍疾病奠定基础。蜜蜂是群居性昆虫， 疾病的传播是很快的，如果对于患病蜂群不能迅速 找出病因对症下药的话，会造成极大减产，甚至造成 蜂群整体死亡。从分子生物学水平来研究蜜蜂疾 病，可以为尽快找出病因提供科学可靠的技术手段。 参考文献： ［１］Ｋｕｂｏｔａ Ｍ，Ｔｓｕｊｉ Ｍ，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｍ，ｅｔ １ａ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ—ｇｌｕ— ｃｏｓｉｄａｓｅｓ Ｉ，ＩＩ，ａｎｄ Ｉｌｌ ｉｎ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｈｏｎｅｙｂｅｅｓ，Ａｐ ｆ够 ｅｒａ Ｌ．，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｈｏｎｅｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｃｅｈｅｍ，２００４，６８（１ １）：２３４６—２３５２． ［２］Ｗｏｎｇｃｈａｗａｌｉｔ Ｊ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，Ｎａｋａｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ 越性。同时中华蜜蜂也有较好的耐热能力，适应南 ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｈｏｎｅｙｂｅｅ ｆ Ａ 方的炎热气候，能顺利度过夏天。并且还具有很强 ｐｌｓ ｃｅｒａｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｔｓ ｃＤＮＡ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ 的抗螨危害的能力，比意大利蜜蜂飞行更灵敏，可以 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００６，７０（１２）：２８８９—２８９８． 有效地避免其他捕食性天敌的危害，更能适应山区 ［３］ＯｈａｓｈｉＫ，ＳａｗａｔａＭ，ＴａｋｅｕｃｈｉＨ，ｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ ｃＤＮＡ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ 的地理环境，在我国平均饲养量约２００万～３００万 ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｇｌａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｎｅｙｂｅｅ Ａｐ ｍｅｌｌｆｌｅｒａ Ｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ 群，约占总饲养蜂群的１／３ ８ Ｊ。我国作为世界第一 Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９６，２２１（２）：３８０—３８５． 养蜂大国，具有丰富的蜜蜂资源，但是我国蜜蜂研究 ［４］Ｌｅ ＣｈｅｖｌａｉｅｒＰ，Ｓｅｌｌｏｓ Ｄ，ＶａｎＷｏｒｍｈｏｕｄｔＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ 目前还较落后，尤其是分子生物学研究方面更是薄 ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｇｌａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ 弱，所以加强这方面的研究是非常必要的。 ｓｈｒｉｍｐ，Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２０００，５７（７）： ｌｌ３５一ｌ１４３． ｏｔ一葡萄糖苷酶（ｏｔ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）是蜜蜂体内的 ［５］Ｈｏｓｔｉｎｏｖａ Ｅ，Ｓｏｌｏｖｉｃｏｖａ Ａ，Ｇａｓｐｅｒｉｋ Ｊ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ 一种重要的代谢酶，蜜蜂的许多疾病都与它密切相 ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎａ ａｌｐｈａ—－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ ｈｏ— 关，因此，研究蜜蜂Ｏｔ一葡萄糖苷酶可以为蜜蜂疾病 ｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｆａｍｉｌｙ ＧＨ３１ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 的防治提供一定的理论基础。但是迄今为止，有关 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，６９：５１—５６． Ｏｔ一葡萄糖苷酶的研究主要集中在意大利蜜蜂和日 ［６］Ｈｏｎｅｙｂｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｏｃｉｌａ ｉｎ－ 本蜜蜂上，中华蜜蜂的研究尚未见报道。Ｏｈａｓｈｉ等 ｓｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｈｔｅ ｈｏｎｅｙｂｅｅ Ａｐ ｍｅＺＺ￣ｒａ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００６，４４３（７１１４）：９３１—９４９． 对意大利蜜蜂体内的Ｏｔ一葡萄糖苷酶进行了ｃＤＮＡ ［７］Ｍｉｎｅｔｏｋｉ Ｔ，Ｇｏｍｉ Ｋ，Ｋｉｔａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅ＇ｎｃｅ ａｎｄ 克隆和表达分析 ；Ｋｕｂｏｔａ等对意大利蜜蜂体内的 ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ—ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ（ａｇｄＡ）ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒ－ 葡萄糖苷酶进行了定位研究…；Ｗｏｎｇｃｈａｗａｌｉｔ等从 ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｃｅｈｅｍ，１９９５，５９（８）：１５１６— 日本蜜蜂中纯化出该种酶，进行了理化分析，并且对 １５２１． 它的ｃＤＮＡ进行了克隆 。 ［８］Ｓｈｉ Ｗ Ｊ，ｘｕ Ｈ Ｊ，Ｃｈｅｎｇ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｇｅｎｅ ０ｆＡｐ ｃｅｒａｎａ ｃｅｒａｎａ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ， 本研究依据意大利蜜蜂的Ｏｔ一葡萄糖苷酶基因 ２００４，３７（１）：２１３—２１９． 序列保守区设计引物，克隆了中华蜜蜂Ｏｔ一葡萄糖
