中华蜜蜂OBP3基因的克隆_原核表达及组织表达谱_吉挺

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

吉

1

挺，沈

1

芳，梁

2314勤，吴黎明，刘振国，罗岳雄

（1．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2．福建农林大学蜂学院，福州350002；

3．中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093；4．广东省昆虫研究所，广州510260）

摘要：【目的】气味结合蛋白质（odorantbindingproteins，OBPs）参与气味分子的识别，在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角

PCＲ技术从中华。【方法】运用ＲT-色。本研究旨在克隆中华蜜蜂ApisceranaceranaOBP3基因，以制备多克隆抗体

28a并转入大肠杆菌Escherichiacoli蜜蜂头部总ＲNA中扩增OBP3基因，将该基因亚克隆入原核表达载体pET-Ｒosetta（DE3）中诱导表达获得融合蛋白质，融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，最后分别用间

接ELISA和WesternBlot检测抗体的效价和特异性，并采用荧光定量PCＲ检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表

PAGE结果。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357），大小为444bp。SDS-达

显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40000，且具有很高的特异性。荧光定量PCＲ结果表明，AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P＜0．01），胸部中次之（P＜0．01），头部和腹部中显著低表达，后两者

）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原表达量差异不显著（P＞0．05

核表达，并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体，为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础。关键词：中华蜜蜂；OBP3基因；基因克隆；原核表达；组织表达谱；抗备

6296（2014）08-07-08中图分类号：Q966文献标识码：A文章编号：04-

Cloning，prokaryoticexpressionandtissueexpressionprofilingofan

OBP3geneintheChinesehoneybee，Apisceranacerana（Hymenoptera：Apidae）

JITing1，SHENFang1，LIANGQin2，WULi-Ming3，LIUZhen-Guo1，LUOYue-Xiong4（1．Collegeof

AnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou，Jiangsu225009，China；2．CollegeofBeeScience，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，China；3．InstituteofApicultureＲesearch，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100093，China；4．GuangdongEntomologicalInstitute，Guangzhou510260，China）Abstract：【Aim】Odorantbindingproteins（OBPs）areinvolvedintheidentificationofodormolecules，andplayanimportantroleinbees’olfaction．ThisstudywasdesignedtocloneandexpressanOBP3genefromtheChinesehoneybeeApisceranacerana，inordertopreparethepolyclonalantibody．【Methods】TheOBP3genewasamplifiedbyＲT-PCＲfromtotalＲNAfromheadofA．ceranacerana，

thensub-clonedintoprokaryoticexpressionvectorpET-28aandexpressedinEscherichiacoliＲosetta

（DE3）hostcells．ThefusionproteinwaspurifiedandimmunizedintoNewZealandwhiterabbitssoastopreparepolyclonalantibody．ThesensitivityandspecificityofthepolyclonalantibodyweredetectedthroughindirectELISAandWesternblot，respectively．TheexpressionprofilesofAccOBP3indifferenttissuesweredetectedbyreal-timequantitativePCＲ．【Ｒesults】AccOBP3（GenBankaccessionno．

KJ026357）wasclonedanda444bpfragmentwasobtained．TherecombinantvectorpET-OBP3was

successfullyconstructed．SDS-PAGEanalysisshowedthatthefusionproteinwaswellexpressed．The

anti-OBP3polyclonalantibodyshowedhightiter（higherthan1∶40000）andspecificity．Ｒeal-time

quantitativePCＲresultsshowedthattheexpressionlevelofAccOBP3genewassignificantlyhigherinlegsandantennae（P＜0．01），moderateinthorax，andsignificantlylowerinheadsandabdomen（P＜

45-SYZ6）；江苏省科技支撑计划课题（SBE201230535）基金项目：国家自然科学基金项目（31372382）；国家蜂产业技术体系（CAＲS-1974年生，江苏东台人，博士，副研究员，研究方向为蜜蜂遗传资源调查分析和保护，E-mail：tji@yzu．edu．cn作者简介：吉挺，男，

03-28；接受日期Accepted：2014-05-28收稿日期Ｒeceived：2014-

8昆虫学报ActaEntomologicaSinica57卷

0．01）．TheexpressionlevelofAccOBP3inheadsandabdomenhadnosignificantdifference（P＞0．05）．【Conclusion】TheOBP3genehashightranscriptexpressionintheantennaeofA．ceranacerana．Inthisstudy，AccOBP3genehasbeenclonedandexpressed，andtherabbitanti-ApisCeranaOBP3polyclonalantibodyhasbeenpreparedbyimmunizationwiththepurifiedrecombinantOBP3protein，whichlaysthefoundationforfurtherstudiesonfunctionsofOBP3gene．

Keywords：Apisceranacerana；OBP3gene；genecloning；prokaryoticexpression；tissueexpressionprofiles；antibodypreparation

昆特殊的嗅觉系统对于昆虫有着重要的作用，

虫通过嗅觉感受器来获取环境中的气味信息，将化学信号传递到被激活的大脑中枢神经元中，进而调节昆虫相应的行为，如觅食、交配、产卵、同族识别及躲避敌害等（Ｒobertsonetal．，2003；Swansonetal．，2009）。位于昆虫嗅觉感受器内的气味结合蛋白质（odorantbindingproteins，OBPs）家族与挥发性小分子气味物质的结合是昆虫专一识别外界气味最先的生化反应，这对昆虫与外界环境进行化学信息交流1999）。昆虫气味结合蛋具有重要意义（Vogtetal．，

白质是一类低分子量水溶性酸性蛋白质（吴少英2005），等，有6个保守的半胱氨酸位点，具有相似的2001）。根据其结水溶性及次级结构（Briandetal．，合的配体、同源性以及其在不同感器上的表达类型，可以将昆虫OBPs家族分为性外激素结合蛋白质（pheromone-bindingprotein，PBP）、普通气味结合蛋bindingprotein，GOBP）和其白质（generalodorant-他类型的触角气味结合蛋白质，如ABPX，SAP等（Vogtetal．，1999）。中华蜜蜂Apisceranacerana，简称中蜂，是生活于我国境内东方蜜蜂的地理品种，其嗅觉灵敏，抗螨能力强，善于利用零星分散的蜜粉2007）。源，是我国重要的饲养蜂种之一（王凤鹤等，中蜂优越性状，特别是抗螨能力得益于其具备的敏2012），锐嗅觉（Tsurudaetal．，嗅觉的敏感性与气味信息物质的精确识别及信号传导是密不可分的（Arechavaleta-Velascoetal．，2012），而OBPs直接参与了嗅觉感器与外界气味分子的化学反应（Koand

Park，2008），因此对中蜂OBPs性质及作用的了解，对揭示中蜂优越的蜜粉源搜寻能力、抗螨能力等性状分子机理尤为重要。目前所发现的西方蜜蜂Apismellifera主要OBPs一般归簇于第9号染色体并在嗅觉组织中表达，然而这些OBPs似乎并不完全处于同一个因子的控制之下，因为该簇中的核心基因OBP3，并不在触角中表达而在其他器官中表达（ForêtandMaleszka，2006）。那么嗅觉灵敏性优于西方蜜蜂的中华蜜蜂的OBP3的表达规律又是

怎样的？它在中蜂的嗅觉系统中究竟起着怎样的作用？它和其他的OBPs之间又有着怎样的关联？这些问题的揭示将为了解中蜂OBP家族的功能提供重要线索。

目前国内外对于中蜂气味结合蛋白研究相对较

2013）对ASP2进行了CDs的克少，李红亮等（2008，隆，并对其功能模式进行了分析；张小辉等（2010）

克隆了中华蜜蜂气味结合蛋白完整的基因序列。但未见有中华蜜蜂OBP3的相关报道。本研究根据已知的西方蜜蜂OBP基因序列，首次克隆中华蜜蜂OBP3基因序列，OBP3原核表达载体，并构建pET-成功免疫新西兰大耳兔获得OBP3多克隆抗体，为更深入研究蜜蜂OBP3基因，进一步探讨重组pET-OBP3的生物学功能奠定基础。

1

1．1

材料和方法

实验材料

本研究所用中华蜜蜂由广东省广州市番禹石基

镇的广东昆虫研究所下属实验蜂场提供，所选蜜蜂投入液氮中处死。将液氮中保存的中华蜜蜂取出，将其头部（带触角）与身体其余部分分离，液氮速冻

28a载体由本实后放入－70℃冰箱保存、备用；pET-验室保存。1．2

主要试剂

反转录试剂盒FirstStrandcDNASynthesisKit、rTaq聚合酶、pMD19-TSimple小量胶回收试剂盒、

Vector试剂盒、T4DNA连接酶、BamHⅠ、HindⅢ限EscherichiacoliDH5α感受态细胞、DL-制性内切酶、500、DL-5000DNAMarker和荧光定量试剂盒（DＲＲ081A）均购自大连宝生物公司；E．coliＲosetta（DE3）感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；预染蛋白arker购自Fermentas公司；诱导培养基购自上海文渊阁生物科技有限公司；His-BindPurificationKit试剂盒购自Novagen公司；辣根

8期吉原核表达及组织表达谱挺等：中华蜜蜂OBP3基因的克隆、9

过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自上海江莱生物科

技有限公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。1．3

引物的设计与合成

根据NCBI检索到的西方蜜蜂OBP3mＲNA序

GI：列（GenBankaccessionno．：NM_001040221，

取超声波破碎后的包涵体沉淀，将沉淀称重，每

4℃搅拌溶解过克沉淀加入10mLBindingBuffer，

BindPurificationKit夜。蛋白纯化具体操作按His-试剂盒进行，纯化产物用于免疫新西兰白兔。1．7

抗血清的获得

初次免疫，将纯化蛋白与弗氏完全佐剂按体积

94158728），F：运用Oligo7软件设计引物（OBP3-AAggatccTGAAGACCATCGTCATCCT；OBP3-Ｒ：GGaagcttCTCTCTTCTTCGCTCGTTG），并在上下游引入酶切位点BamHⅠ和HindⅢ（小写字母为酶切位点）。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。1．4

OBP3基因cDNA的扩增及TA克隆

Trizol法提取中华蜜蜂头部组织的总ＲNA。以

比1∶1充分混匀，分别对2头新西兰白兔进行背部皮下多点注射（共计500μg/头）。2周后用弗氏不完全佐剂与纯化蛋白等体积混匀皮下注射，以后每2周免疫一次，共加强免疫3次，加强免疫时均使用弗氏不完全佐剂。最后一次免疫1周后，颈动脉采血，分离血清作为一抗。1．8

抗体效价和特异性检测

分别用间接ELISA和Westernblot法检测多抗的效价和特异性。

间接ELISA：纯化的重组蛋白4℃过夜包被ELISA板（1μg/孔），用PBST配制的5%脱脂奶粉37℃封闭1h，PBST洗涤3次（5min/次，以下同）；

37℃多抗血清作为一抗，按照1∶1000的比例稀释，PBST洗涤3次；加入1∶1000稀释的HＲP孵育1h，

37℃孵育1h，PBST洗涤3次后标记山羊抗兔二抗，

加入TMB显色底物，显色15min后加入终止液，酶

标仪检测抗体效价读出A450值。

OBP3融合蛋白Westernblot：融合蛋白经SDS-PAGE电泳后在60V，1．5h条件下电转移至PVDFPBST洗涤3次；膜上；5%脱脂奶粉室温封闭2h，用制备的多抗血清作为一抗，按1∶1000（v/v）稀释4℃过夜轻摇振荡进行孵育，PBST洗涤3次；用后，

1∶1000（v/v）稀释的HＲP标记山羊抗兔IgG作为PBST洗涤3次；最终加入3，3-二抗，室温孵育3h，

28a空载体二氨基联苯胺（DAB）避光显色。以pET-OBP3重组载体诱导前的蛋白作为诱导后及pET-对照。1．9

OBP3内源性蛋白的Westernblot

1．9．1中华蜜蜂头部组织样抽提：在冰台上解剖中华蜜蜂头部，设置3个重复，用剪刀将组织块尽量剪碎，加500μLＲIPA裂解液裂（含PMSF）于匀浆器4℃下中，所有操作均在冰上进行，重复碾压、裂解，14000r/min离心10min，取上清加入SDS上样缓冲液，煮沸10min，缓慢恢复室温后，稍离心，放于－20℃保存待测。1．9．2

BCA法蛋白定量及浓度调整：按照BCA蛋

白定量试剂盒说明书操作，用酶标仪570nm波长滤光片读取不同组别OD值，每组3个重复，计算不同

总ＲNA为模板，参照TaKaＲa公司FirstStrand

cDNASynthesisKit说明书进行反转录，合成cDNA第一链。

以cDNA第一链为模板，扩增OBP3序列。反

PCＲ扩增反应体系参照rTaqDNA聚合酶说明书，

55．7℃应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，

72℃延伸30s，退火30s，共35个循环；72℃最终延

伸10min。PCＲ扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下拍照。鉴定正确的PCＲ产物

TSimple经胶回收试剂盒纯化回收后，与pMD19-Vector在16℃下连接16h，连接产物转化E．coli

DH5α感受态细胞，LB（Amp+）固体培养基培养12h。挑选阳性克隆经酶切鉴定后，将含有正确插入T-OBP3，片段的重组质粒命名为pMD19-送上海生工生物工程技术有限公司测序。1．5

OBP3的构建及鉴定重组质粒pET-用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定正确的

pMD19-T-OBP3，回收目的片段；同时用这两种酶双28a，酶切pET-回收目的载体。目的片段和目的载

16℃连接16h。连体在T4DNA连接酶的作用下，

LB（Amp+）接产物转化E．coliDH5α感受态细胞，

固体培养基培养12h。挑选阳性克隆经酶切鉴定后，将含有正确插入片段的重组质粒命名为pET-OBP3，送上海生工生物工程技术有限公司测序。1．6

融合蛋白的诱导表达和纯化

OBP3质粒转化于感受态将鉴定正确的pET-

+

E．coliＲosetta（DE3），并接种到LB（Amp）液体培

参照上海文渊阁生物科技有限公司的自诱养基中，

37℃最大转速摇菌24h，导培养基说明书，进行融合IPTG终浓度为1mmol/L。诱蛋白的诱导表达12h，

导产物按4∶1（v/v）加入5×SDS上样缓冲液，沸水PAGE电泳检测。中煮5min使蛋白变性，然后SDS-

900昆虫学报ActaEntomologicaSinica57卷

组别蛋白浓度，再以ＲIPA调整蛋白浓度，加入5×还原样品缓冲液使样品终浓度控制在2mg/mL，随后煮沸变性5min。

1．9．3内源性蛋白Westernblot分析：将浓度一致的组织蛋白上样检测（10μg/孔），在60V2h条件下电

PBST转移至PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭2h，洗涤3次；用制备的OBP3多抗血清作为一抗，按

1∶2000（v/v）稀释后，4℃过夜轻摇振荡进行孵育，PBST洗涤3次；用1∶2000（v/v）稀释的HＲP标记山PBST洗涤3次，羊抗兔IgG作为二抗，室温孵育3h，

37℃洗膜30min，然后继续用StrippingBuffer洗膜，

ECL显色，X-ray胶片曝光显影后用CCD镜头扫描，

内参Westernblot实验中除一抗使用Actin多抗，二抗使用山羊抗兔IgG（H+L）HＲP，其余过程和内源性蛋

one软白Westernblot过程完全一致，最后用Quantity-件读取内源性蛋白和内参蛋白灰度值。

1．10OBP3基因在中蜂不同组织中的表达水平检测中蜂各组织总ＲNA用Trizol试剂提取，反转录

qPCＲ）均按各自试剂反应、实时荧光定量PCＲ（ＲT-盒说明书操作。实时荧光定量PCＲ反应体系配置

actin为内参基因，均在冰台上进行，以β-每个样品设3个重复，反应程序如下：先95℃预热30s；接着

进行40个循环的复制，退火温度为60℃；最后以95℃15s，60℃60s，95℃15s，这一过程生成溶解

qPCＲ反应结束后系统根据荧光值的变曲线。ＲT-化规律，自动生成反应循环数与检测荧光量变化的

扩增反应动力学曲线，用SDS1．4软件对扩增结果进行观测。

1．11数据统计与分析

采用ABI7500荧光定量PCＲ仪相应软件进行

EXCEL整理数据。相对定量结果采用数据分析，

2－△△Ct法进行处理（LivakandSchmittgen，2001）。基因与蛋白相对表达差异用SPSS18．0单因素方差分析法进行差异显著性分析，结果以平均值±标准差表示。

图1

中华蜜蜂OBP3基因cDNA的PCＲ扩增结果Fig．1

PCＲamplificationresultsofcDNAofOBP3geneinApisceranacerana

1：目的基因Targetgene；M：DNA相对分子质量标准物DL500DNAmarker．

（GenBank登录号：KJ026357）。2．1．2

中华蜜蜂与西方蜜蜂OBP3基因比对：由图

2可知，经DNAman软件比对结果显示，中华蜜蜂与

西方蜜蜂OBP3基因的mＲNA序列一致性达到77．71%。西方蜜蜂与中华蜜蜂相比，前者在第51－53位存在3个碱基（cag）的缺失，使得其编码的氨基酸缺少一个谷氨酰胺（Q）；第68－77位存在10使编码缺失天冬酰胺（N）、个碱基（caatgtcgac）缺失，

缬氨酸（V）和天冬氨酸（D）；在266－268位存在3使编码增加一个天冬氨酸（D），个碱基（tat）插入，

并且其后面的氨基酸由谷氨酸（E）变为甲硫氨酸（M）；在274－276位存在3个碱基（tgg）插入，使编码增加一个甲硫氨酸（M），并且其后面的氨基酸由天冬氨酸（D）变为天冬酰胺（N）；在420－422位存

使编码增加一个丙氨酸在3个碱基（gca）插入，

（A）。在第84，96，112，128，129，144，148，157，159，161，192，201，217，231，233－234，246，262－263，280－281，287，2，299，307－308，318，321，348－349，3，367，372－374，393－395，400－401，406－407，411－412，417－419，420，432和452位点，存在

a/g（Ｒ/E），a/c（N/T），t/a（D/Q），t/c着a/t（T/S），

（S/P），g/a（E/K），g/a（S/N），t/c（M/T），c/a（L/I），g/a（L/I），t/c（F/L），t/a（L/M），a/g（D/G），g/a（V/M），tc/ca（S/Q），g/a（V/I），ca/tg（T/M），tg/aa（L/Q），c/g（D/E），g/a（S/N），a/c（Ｒ/N），gc/ag（Ｒ/Q），g/a（D/N），a/g（N/D），ac/gt（T/V），g/c（S/T），g/a（Ｒ/K），gtc/ctt（V/L），cat/tac（H/Y），cg/aa（I/K），ac/tt（Y/F），at/ta（I/Y），aac/ttt（N/

2

2．1

结果

OBP3基因的克隆及生物信息学分析

2．1．1中华蜜蜂OBP3基因的克隆：以中华蜜蜂头部总ＲNA为模板进行反转录，再以反转录得到的cDNA为模板扩增中华蜜蜂OBP3基因序列。结果PCＲ产物在450bp左右有明显的条带（图显示，1），与预期444bp相符，并将其命名为AccOBP3

8期吉原核表达及组织表达谱挺等：中华蜜蜂OBP3基因的克隆、901

F），g/c（A/－），a/t（T/S）和c/a（S/Ｒ）的有义突变。2．1．3

不同昆虫OBP3基因系统进化树的构建：为

了进一步探讨部分昆虫类OBP3基因编码区的进

蜂比较，并将核苷酸序列转换为氨基酸序列进行比对，运用MEGA5软件采用NJ法构建系统进化树（图3）。结果表明，所有比较的物种大致分为两个不同的群体，中华蜜蜂与西方蜜蜂首先聚为一类，并与其他昆虫聚为一类，该结果符合物种进化规律，说

化，特收集了西方蜜蜂，棉铃虫，褐家鼠，拟南芥，家

蚕等14个物种的OBP3基因编码区序列与东方蜜

图2

Fig．2

西方蜜蜂与中华蜜蜂OBP3基因碱基突变位点及对应氨基酸变异情况

ThemutantlociandtheircorrespondingaminoacidsintheOBP3genesofApismelliferaandA．ceranacerana

红色三角区示核苷酸和氨基酸的变异。Ｒedtrianglesindicatethevariationsofnucleotidesandaminoacids．

图3

Fig．3

昆虫OBP3基因mＲNA序列构建的系统进化树

PhylogenetictreebasedonthemＲNAsequencesofOBP3genesfromdifferentinsects

利用MEGA5软件链接NCBI网站，选择核酸数据库，添加包括东方蜜蜂在内的11个物种mＲNA序列，先用Clusta做多序列比对，然后用邻位连接法构建系统进化树，重复抽样1000次。图3中数字为Bootstrap检验值，表示该分支通过Bootstrap检验的次数占总次数的百分比，该数值越大，即表示构建进化树的可信度越高；Bootstrap值大于70的分枝较为可信。WelinkMEGA5softwaretoNCBIwebsite，selectnucleicaciddatabaseandaddthemＲNAsequencesfrom11speciesincludingApisceranacerana．MultiplesequencealignmentisdonethroughClustaandthenphylogenetictreeisconstructedbyNeighbor-Joiningmethod，repeatedlysamplingfor1000times．DatainFig．2arethevaluesofBootstraptest，whichindicatethepercentageofeachbranchtimethroughBootstraptestintotaltimes．Thegreaterthevalueis，thehighercredibilitythephylogenetictreewillbe．Generally，brancheswiththeBootstrapvaluesgreaterthan70aremorecredible．

902昆虫学报ActaEntomologicaSinica57卷

明用OBP3基因构建进化树是可靠的。进化树结果同时提示中华蜜蜂AccOBP3与西方蜜蜂OBP3在功能上没有大的分化。

2．2重组表达载体pET-OBP3的鉴定

TSimple将PCＲ产物切胶回收后与pMD19-Vector连接，T-得到的重组质粒命名为pMD19-OBP3。用BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定（图4：A），可见在2．7kb和444bp处有明

显条带，这与预期一致，且测序结果显示100%序列一致性，无任何碱基突变。

Fig．5

图5

pET-OBP3融合蛋白的诱导表达

InducedexpressionofthepET-OBP3fusionprotein

M：蛋白质相对分子质量标准物Proteinmarker；1：重组质粒转化BL21菌诱导后ExpressedproductofpET-OBP3induced．箭头示融合蛋白。Thearrowindicatesthefusionprotein．

图4

Fig．4

重组表达载体的构建

Constructionofrecombinantexpressionvector

A：pMD19-T-OBP3质粒双酶切鉴定结果EnzymedigestionofpMD19-T-OBP3；B：pET-OBP3质粒双酶切鉴定结果EnzymedigestionofpET-OBP3．M：DL5000DNAmarker；1：BamHⅠ和HindIII双酶切pMD19-T-OBP3质粒EnzymedigestionofpMD19-T-OBP3byBamHⅠandHindIII；2：BamHⅠ和HindIII双酶切pET-OBP3质粒EnzymedigestionofpET-OBP3byBamHⅠandHindIII．

图6兔抗中蜂OBP3多克隆抗体特异性的Westernblot检测Fig．6

Specificityofrabbitanti-AccOBP3polyclonalantibodydetectedbyWesternblotting

T-分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pMD19-OBP3和pET-28a，连接回收的目的片段和目的载OBP3。用这两种体，将重组表达载体命名为pET-酶对重组质粒进行双酶切鉴定（图4：B），可见在5．3kb和444bp处有明显条带，这与预期一致，且测序结果显示100%序列一致性，无任何碱基突变。OBP3构建成功。表明重组表达载体pET-2．3融合蛋白的诱导表达及纯化

OBP3转化入大肠杆菌E．coli将重组质粒pET-Ｒosetta（DE3）中进行表达。OBP3序列片段编码147个氨基酸残基（16kDa），28a组成编码与pET-193个氨基酸（其中包括两个连续6个组氨酸标签、9个T7标签在内的46个氨基酸为载体核苷酸编码）的融合基因，计算它的理论分子量为24．7kDa。SDS-PAGE电泳图（图5）表明，OBP3所表达的pET-融合蛋白大小约38kDa。WesternBlot分析（图6）可见，表达的重组蛋白可以与兔抗蜜蜂OBP3抗体

M：蛋白相对分子质量标准Proteinmarker；1：纯化的融合蛋白Purifiedfusionprotein．

发生了特异性血清学反应，表明中华蜜蜂OBP3在

E．coli中实现了表达。经ELISA测定，抗体滴度大于40k，为合格抗体。

2．4OBP3内源性蛋白Westernblot

中华蜜蜂头部AccOBP3蛋白以及内参蛋白Westernblot结果见图7。采用quantity-one软件分别读取OBP3蛋白和内参Actin蛋白灰度值，计算其3个泳道的灰度值分别为0．4，0．603和0．3，表明重复性良好，制备抗体有效。

2．5OBP3基因在中蜂不同组织间的差异表达

－C

采用2△△t法分别计算AccOBP3基因在中蜂触角、头、胸、腹、腿等不同组织的相对表达量，结果

PCＲ扩增结果表明，见图8。ＲT-目的基因和内参基

PCＲ产物只有1个特异峰，因ＲT-产物特异性很好，

8期吉原核表达及组织表达谱挺等：中华蜜蜂OBP3基因的克隆、903

上清中很难找到融合蛋白，表达产物几乎全部以包

4T-1系统的高涵体沉淀形式存在，这可能与pGEX-效表达有关。蛋白表达量越高越容易形成包涵体，

其原因一方面可能是蛋白合成的速度太快，以至于

图7

中华蜜蜂OBP3内源性蛋白Westernblot结果WesternblottingresultofOBP3endogenousproteininApisceranacerana

Fig．7

没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确地配对；另一方面，促使蛋白正确折叠的各种影响因子在原核表达系统中有所缺失，这也在一定程度上促进了包涵体的形成。本实验中，我们将包涵体沉淀经His-BindNi柱纯化后免疫新西兰白兔，不影响多克隆抗体的制备。Westernblot检测抗体特异性，结果显示抗体效价高且特异性好，中华蜜蜂AccOBP3多克隆抗备成功。本研究获得了中华蜜蜂AccOBP3基因cDNA全长序列，并成功获得多克隆抗体，研究为AccOBP3免疫定位及其生物学功能的研究奠定了良好的基础。

AccOBP3基因在荧光定量PCＲ检测结果表明，

中华蜜蜂触角、头、胸、腹、腿等不同组织都有表达，表达程度不一，其中在腿部中表达量最高，其次为在触角中。Forêt和Maleszka（2006）的研究发现，OBP3在西方蜜蜂除了触角的各个身体部位都有表达，这与OBP3基因在中华蜜蜂分布情况明显不同。中华蜜蜂是东方蜜蜂种下的一个亚种，与西方蜜蜂作为两个不同的物种，虽然具有很近的亲缘关系，但

可用于荧光定量的进一步分析。从无引物二聚体，

AccOBP3基因荧光定量PCＲ检测结果表图8可见，

AccOBP3基因在中华蜜蜂触角、明，头、胸、腹、腿等

不同组织都有表达，表达程度不一，其中在腿部与触角表达量最高，其次为胸部，在腹部表达量最低差异显著性采用SPSS16．0软件运算。

图8Fig．8

ＲT-qPCＲ检测AccOBP3在中华蜜蜂各组织中的相对表达量

在生活习性上有许多不同之处。中华蜜蜂是我国特有的优良地方品种，具有飞行敏捷、嗅觉灵敏等特点，能够有效地利用种类繁多的零星蜜源。此外，中蜂具有极强的抗蜂螨能力，有研究发现其灵敏的嗅2005），觉在抗螨行为中发挥了重要作用（李江红，而西方蜜蜂普遍易受蜂螨侵染，螨害是影响西方蜜蜂养殖最主要的因素（Martinetal．，2001）。触角是

AccOBP3基因在在中蜂触蜜蜂重要的嗅觉感受器，

角高表达，而在西方蜜蜂触角中不表达（Forêtand

Maleszka，2006），AccOBP3在两这个结果提示我们，而在两个物种中个蜂种中承担着不同的生理功能，

的功能差异很可能是导致两个物种嗅觉灵敏度、抗螨性能等生物特性差异的原因之一。结合进化树分析结果，中华蜜蜂AccOBP3与西方蜜蜂OBP3在功能上没有大的分化，推测中华蜜蜂与西方蜜蜂头部AccOBP3转录活性的差异可能源于中、西蜂头部AccOBP3基因的启动子活性的差异，这也是本研究后续需要关注的重点。

综上所述，本实验成功克隆了中华蜜蜂OBP3基因，并诱导融合蛋白表达，制备了兔抗蜂OBP3多克隆抗体；实时荧光定量PCＲ数据显示该基因在中

ＲelativeexpressionlevelofAccOBP3indifferent

tissuesofApiscerenacerenadetectedbyＲT-qPCＲ

An：触角Antenna；H：头部Head；T：胸部Thorax；Ab：腹部Abdomen；L：腿部Leg．

3讨论与结论

本研究首次克隆中蜂AccOBP3基因，经DNAman软件比对结果显示，中华蜜蜂与西方蜜蜂的mＲNA序列一致性达到77．71%，进化树构建结果也显示两个蜂种OBP3基因亲缘性较高。与西方

AccOBP3在多个位点上出现碱基缺失、蜜蜂相比，插入和有义突变，体现了两者在物种上的差别，这些突变与两个蜂种间嗅觉敏感性差异的关联还需要进一

步的探索。

本实验构建中蜂AccOBP3基因的重组原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，通过自诱导培养基成功诱导表达出中蜂AccOBP3基因融合蛋白。重组菌诱导表达后，在细胞破碎后的

904昆虫学报ActaEntomologicaSinica57卷

华蜜蜂各个组织均有表达，表现为腿部和触角中显著高表达（P＜0．01），胸部中次之（P＜0．01），头部和腹部中显著低表达，后两者表达量差异不显著（P＞0．05）。Westernblot结果显示抗备的特异性，为后续检测OBP3蛋白在中华蜜蜂不同组织部位表达情况奠定基础。

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（责任编辑：赵利辉）