第十章DNA的生物合成（复制）

第三篇基因信息的传递 flow of gene information

从生物化学意义上说，基因是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA。蛋白质是生命活动的执行者。通过基因转录和翻译，由DNA决定蛋白质的一级结构，从而决定蛋白质的功能。DNA还通过复制，将基因信息代代相传。1958年，F. Crick把上述遗传信息的传递方式归纳为遗传的中心法则。1970年逆转录现象被发现后，中心法则得以补充，称为补充了的中心法则。

遗传的中心法则体现了以下的内容：DNA通过复制，可将基因信息代代相传；DNA通过基因表达，决定了蛋白质的结构、功能；RNA参与DNA遗传信息的表达；RNA也可作为某些病毒遗传信息的载体。从中心法则，我们还知道DNA的生物合成有两种方式：DNA 复制和逆转录，以DNA复制为主要方式；RNA的生物合成也有两种方式：转录和RNA复制，以转录为主要方式。

本篇的主要内容有复制、转录、翻译、基因表达和基因工程。其中{基因表达}指通过转录和翻译，将DNA分子上A、G、C、T四个符号所包含的信息，转变为蛋白质分子上20种氨基酸的信息。

第十章DNA的生物合成（复制） Biosynthesis of DNA （replication）

一、授课章节及主要内容:第十章DNA的生物合成（复制） 二、授课对象：临床医学、预防、法医（五年制）、临床医学（七年制）

三、授课学时

本章共4节课时（每个课时为45分钟）。讲授安排如下： 第一学时：讲述遗传信息传递的规律；DNA半保留复制的定义、实验依据和意义。

第二学时：讲述参与DNA复制的物质及其作用。 第三学时：讲述DNA生物合成的过程。

第四学时：了解逆转录现象和逆转录酶，讲述DNA损伤与修复。 四、教学目的与要求

通过本章内容的学习，学生应掌握遗传的中心法则，DNA复制的定义、规律、DNA 复制的酶学、基本过程以及了解逆转录现象和逆转录酶，DNA损伤与修复。

五、重点与难点

重点：遗传信息传递的规律；DNA半保留复制的定义和意义，参与DNA复制的物质及其作用，DNA复制的主要特点；逆转录的概念，修复的概念。

难点：DNA复制的基本过程，尤其是复制的起始；真核生物的端粒和端粒酶。

六、教学方法及授课大致安排

主要为面授。要求学生课前预习，课后复习。课堂面授中结合提问、讨论、复习。每节课结束时要小结，本章结束时要小结。

七、外语讲授安排及主要外文专业词汇

replication，semiconservative replication，replicon，origin，DNA polymerase，DNA-pol，Klenow fragment，exonuclease，leading strand，lagging strand，helicase，topoisomerase，single strand DNA binding protein，SSB. primase，primosome，DNA ligase，replication fork，bidirectional replication，primosome，Okazaki fragment，termination，proliferatioin cell nuclear antigen, PCNA. telomere，telomerase，Reverse transcription，complementary DNA，rolling -loop replication，mutation，DNA damage，mismatch，point mutation，deletion，insertion ，frame-shift mutation，rearrangement，DNA repairing ，light repairing，recombination repairing，excission repairing

八、思考题

1. 参与原核生物DNA复制过程所需的物质包括有哪些？ 2. DNA复制为什么能准确的将遗传信息转递给下一代，其机制是

什么？

3. DNA复制的基本过程是什么？

4. DNA半保留复制中，两条新合成的链为什么是半不连续性合成？ 5. 遗传的中心法则包含的内容是什么？

6. 引起DNA损伤的因素是什么？损伤的修复方式有哪些？ 7. 逆转录的基本过程是什么？

九、教材与教具：人民卫生出版社《生物化学》第六版 十、授课提纲（或基本内容） 第三篇基因信息的传递 flow of gene information

从生物化学意义上说，基因是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA。蛋白质是生命活动的执行者。通过基因转录和翻译，由DNA决定蛋白质的一级结构，从而决定蛋白质的功能。DNA还通过复制，将基因信息代代相传。1958年，F. Crick把上述遗传信息的传递方式归纳为遗传的中心法则。1970年逆转录现象被发现后，中心法则得以补充，称为补充了的中心法则。

遗传的中心法则体现了以下的内容：DNA通过复制，可将基因信息代代相传；DNA通过基因表达，决定了蛋白质的结构、功能；RNA参与DNA遗传信息的表达；RNA也可作为某些病毒遗传信息的载体。从中心法则，我们还知道DNA的生物合成有两种方式：DNA 复制和逆转录，以DNA复制为主要方式；RNA的生物合成也有两种方式：转录和RNA复制，以转录为主要方式。

本篇的主要内容有复制、转录、翻译、基因表达和基因工程。其中{基因表达}指通过转录和翻译，将DNA分子上A、G、C、T四个符号所包含的信息，转变为蛋白质分子上20种氨基酸的信息。

第十章DNA的生物合成（复制） biosynthesis of DNA

复制(replication): 是指由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。

本章主要内容：复制的特征；参与复制的物质；复制的过程；

DNA损伤与修复；逆转录生成DNA。

第一节复制的基本规律 basic laws of replication

亲代双链复制出子代双链的DNA，有三种可能情况，即全保留式、半保留式和混合式的复制（见图10－3）。最早证明DNA半保留复制的实验是由M. Meselson和W. F. Stahl完成的。他们利用E.coli能利用NH4Cl作为氮源合成DNA的特性，将E.coli在含15NH4Cl的培养液中培养，一直到所有细胞的DNA都含有了重氮15N（H），然后再将细胞转到含14NH4Cl的培养液中继续培养，新合成的DNA应该含有轻氮14N（L），收集不同时期的培养物，提取细胞DNA并经密度梯度离心分析，按照15N-DNA（H）和14N-DNA（L）密度的不同可区分H-H、L-L和H-L三种双螺旋DNA分子。结果发现，子代DNA分子中一条链为15N-DNA（H），另一条链为14N-DNA（L），随着代数的增加，15N-DNA（H）按1/8、1/16等的方式逐渐减少，由此证实DNA复制是半保留的（见图10－2）。随后，有人采用培养植物细胞的方式证明了真核细胞染色体DNA的复制也是半保留复制。可见，真核细胞和原核细胞的DNA复制都是采用半保留复制机理。

半保留复制(semiconservative replication)：

当DNA进行复制时，双螺旋结构解开成两条单链，各自作为模板合成与之互补的新链。在子代DNA双链中，一条是来自于亲代，另一条完全重新合成。这种复制方式称为半保留复制（见图10－1）。

半保留复制的意义：按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

双向复制（bidirectional replication）：

原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。从图10－4可以看到最早生成两个方向相反的引物和两个延伸方向相反的复制叉。复制叉是指DNA双链解开分成两股，各自作为模板，子链沿着模板延长所形成的Y字形结构。

真核生物的染色体庞大、复杂，有多个复制起始点，同时进行多个DNA片段的复制。两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子（replicon）（见图10－5），真核生物也是双向复制。

复制的半不连续性（semidiscontinuous replication）： 在同一复制叉上，解链的方向只能有一个。因此，顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链（leading strand）。而另一股链复制的方向却与解链方向相反，这股链的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从5?→3?方向生成引物然后复制。这股链在延长时，又要等到下一段暴露出足够长度的模板，再次生成引物而延长。这一股不连续复制的链称为随从链（lagging strand）。由于领头链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的（见图10－6），所以DNA复制是半不连续复制）。

第二节DNA复制的酶学和拓扑学变化

复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质的共同参与。

参与DNA复制的酶类等物质有： 底物为dNTP；

模板为解开成单链的DNA母链； 聚合酶为依赖DNA的DNA聚合酶；

引物酶（primase）DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP互相聚合。第一个dNTP是聚合到已有的寡核苷酸的3'-OH末端上，然后继续延长。这一短链RNA称为引物，它是由引物酶催化合成的。

其他酶和蛋白质因子。

一、DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol）

DNA聚合酶是指能以DNA为模板合成与模板互补配对的新DNA链的酶。原核生物有DNA-pol I、DNA-pol II、DNA-pol III等，真核生物有DNA-pol α、β、γ、δ、ε。

DNA聚合酶具有以下活性：①5?→3?DNA聚合酶活性；②5?→3?外切酶活性；③3?→5?外

切酶活性。

（一）DNA聚合酶催化的反应（catalysis reaction of DNA polymerase）

1．5?→3?聚合酶活性：复制过程是在引物（寡核苷酸）上逐个加入dNTP，使新链不断延长（见图10-7），其化学反应如下：

（dNMP）n+dNTP →（dNMP）n+1+PPi

反应式中的寡核苷酸n，可体会为引物或延长中的新链，其3?-OH与三磷酸脱氧核苷（式中的dNTP）的α-磷酸基起反应，生成3?,5?-磷酸二酯键，因而使n延为n+1。dNTP上的β和γ-磷酸基游离而生成焦磷酸。

新链只能从5?-端向3?-端延长。这就是DNA复制的方向性。由于DNA双螺旋的两股链走向相反，因此复制时也按相反走向各自按模板链指引合成新链。

聚合反应的特点（characteristics of polymerization reaction ）： 聚合反应具有方向性：5?→3?；DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3?-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。

2．核酸外切酶（exonuclease）活性：一般DNA聚合酶都具有核酸外切酶活性，其中从5?末端把核苷酸从核酸链上水解下来，称为5?→3?外切酶活性，能切除突变的DNA片段；而从3?末端把核苷酸从核酸链上水解下来，称为3?→5?外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。

(二）原核细胞的DNA聚合酶（DNA polymerase in prokaryote ） 原核细胞在正常情况下只有pol I和pol III 两个DNA聚合酶起作用（见表10－1）。

1．DNA聚合酶Ⅲ：DNA-pol III 全酶是由10个亚单位、18个聚合酶IIIα-螺旋区构成的蛋白复合体，这种复合体中有一个核心酶，它由α、ε、θ亚基组成，核心酶中α-亚基有5?→3?DNA聚合酶活性。ε-亚基有3?→5?核酸外切酶活性，它可以从生长链的末端切除不正确的核苷酸，起校读和碱基选择作用。

在原核细胞内，pol III是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚合

的酶。pol III的比活性大于pol I 10倍以上，每分钟能催化105个核苷酸聚合（见图10－8）。

2．DNA聚合酶I：DNA聚合酶I具有5?→3?DNA聚合酶活性、3?→5?核酸外切酶活性和5?→3?核酸外切酶活性。①5?→3?DNA聚合酶活性：虽然细胞内pol I含量最多，但其比活性远小于pol III，每秒钟只加入10个核苷酸，所以它不是真正在复制延长中起作用的酶。其聚合酶活性主要体现在复制终止时填补冈崎片段间的空隙。②3?→5?核酸外切酶活性：在三种DNA聚合酶中，pol I的3?→5?核酸外切酶活性最强。③5?→3?核酸外切酶活性：是pol I切除引物、切除突变片段功能所需的（见图10－8）。

综上所述，DNA聚合酶I在活细胞内的功能，主要是对复制中的错误进行校读，切除引物，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

蛋白酶可把pol I水解成大、小两片段，其中大片段有DNA聚合酶活性，也称为Klenow 片段（Klenow fragment），是实验室合成DNA，进行分子生物学研究的常用工具酶。

3．DNA聚合酶Ⅱ：DNA聚合酶Ⅱ具有5?→3?DNA聚合酶活性和3?→5?核酸外切酶活性。它只是在无pol I和和pol III的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚。

（三）真核生物的DNA聚合酶（DNA polymerase in eukaryote ）

真核生物的DNA聚合酶现已发现至少有5种，分别称为DNA-polα、β、γ、δ、ε（见表10－2）。DNA-polα和δ都是在复制延长中起催化作用的。DNA-polε在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。DNA-polβ也只是在没有其他DNA-pol时才发挥催化功能。DNA-polγ在线粒体内，在线粒体DNA复制中起催化作用。

（四）复制的保真性（fidelity of DNA replication）

DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对，使遗传信息延续、传代的保证。总结起来，DNA复制的保真性至少要依赖三种机理：

1．遵守严格的碱基配对规律。

2．聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能。 3．复制中出错时有即时的校读功能。

（见图10-9）表示pol I在复制过程中能辨认错配的碱基并加以切除的功能。图中，模板链是G，新链错配成A而不是C。pol I的3?→5?核酸外切酶活性就把错配的A水解下来，同时利用5?→3?DNA聚合酶活性补回正确配对的C，复制可以继续下去，这种功能称为即时校读。

二、解链、解旋酶类（unwindase, helicase ）

DNA分子只有在松弛螺旋、解开双链使碱基外露后，才能在DNA聚合酶催化下以DNA

为模板按碱基互补的原则进行复制。目前已知参与松弛螺旋与解链的酶及蛋白质主要有解旋酶、拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。

（一）解旋酶（helicase）

解旋酶是指能利用A TP水解产生的能量，将双螺旋DNA链分开成单链的酶。解旋酶具有几个特性：（1）利用A TP水解产生的能量分离两条链形成单链DNA片段；（2）结合到DNA 单链片段上；（3）有方向性；（4）只有运动到链的末端才能从结合的链上解离下来。

（二）拓扑异构酶（topoisomerase）

解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。

拓扑酶广泛存在于原核和真核生物中，主要分为I型拓扑酶和II型拓扑酶两种。拓扑酶对DNA分子的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。其中I型拓扑酶的主要作用是切断DNA 双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态（负超螺旋）。II型拓扑酶又称旋转酶（gyrase），能切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛；利用A TP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。拓扑酶的上述作用，均使复制中的DNA能解结、连环或解连环，达到适度盘绕（见图10－13）。

（三）单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein，

SSB）

细胞内存在单链DNA结合蛋白，SSB通过与已被解旋酶解开的DNA单链紧密结合，维持单链状态，以利于其发挥模板作用。SSB还能与复制新生的DNA单链结合，以保护其免受核酸酶降解。SSB在复制过程中，可以循环利用，发挥其保护单链DNA的作用。

三、引物酶和引发体（primase and primosome）

DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，只能在引物3?-OH连接下一个核苷酸。因此，当DNA复制开始时，首先需要合成一短链RNA作为合成DNA的引物。引物由引物酶合成。引物酶是一种特殊的依赖DNA的RNA聚合酶，它能在模板的复制起始部位催化NTP的聚合，形成短片段的RNA。这一小段RNA作为复制的引物(primer），提供3?-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。

引发体：DNA复制开始时由引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。

四、DNA连接酶(DNA ligase)

DNA连接酶连接DNA链3?-OH末端和相邻DNA链的5?-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。连接酶的催化作用需要消耗ATP。实验证明：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA 单链的作用。DNA连接酶不但在复制中起最后接合缺口的作用，在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口的作用。因此它也是基因工程的重要工具酶之一（见图10－14）。

第三节DNA生物合成过程 process of DNA biosynthesis

DNA复制是个连续的过程，原核生物DNA复制过程与真核生物基本相似，为便于理解，可将DNA复制分为复制起始、复制延长和复制终止三个阶段。但由于原核生物基因组和真核生物基因组在结构和功能上存在的差异，因而两大类基因组DNA的复制也存在一些差异。

一、原核生物的DNA生物合成 biosynthesis of prokarytic DNA

一、复制的起始（initiation of replication）

复制的起始需要解决两个问题：①DNA解开成单链，提供模板；②合成引物，提供3￠-OH 末端。为更好理解复制的起始，首先介绍和重温几个基本概念：

1．复制起始点（E.coli-oriC）：

DNA复制从DNA分子中称为复制起始点（origin of replication，用ori表示）的部位开始，复制起始点由200个左右的碱基对组成。在原核生物中，复制起始点只有一个（见图10－15）。例如oriC是E.coli细菌染色体DNA复制的起始点。oriC长约245bp，含有3组串连重复序列（又称DnaA盒），是DnaA的结合位点，DnaA与oriC的结合可以启动DNA的复制；在oriC相比邻的位置有2对反向重复序列称为富含AT区，富含AT序列似乎在促进局部双螺旋解链方面起重要作用，因为溶解A·T碱基对比溶解G·C碱基对耗能少。

2．复制叉（replication fork）

复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y 字形的结构称为复制叉。

3．双向复制（bidirectional replication）

原核生物例如E.coli，是从固定的复制起始点开始，同时向两个方向进行复制，称为双向复制。

理解了以上的基本概念后，我们来看看复制是如何起始的？ （一）起始复合物的形成（form of initiation complex） DNA复制从DNA分子中称为复制起始点的部位开始，故复制的第一步是辨认复制起始点。复制起始点的辨认需多种蛋白因子（表10-3），不同生物所需要的因子不同。例如E.coli的复制起始点由DnaA蛋白识别。前已述及，E.coli复制起始点oriC含有DnaA盒。复制起始时，DnaA蛋白识别、并结合oriC中的DnaA盒，形成含有20-30亚基的DNA-蛋白质复合物，即起始复合物。

与DnaA盒结合的DnaA蛋白可促使oriC相比邻的AT-富含重复序列局部双螺旋解链，形成开放复合物。此过程需有A TP参与。

（二）引发体的形成（form of primosome）

与DnaA盒结合的DnaA蛋白指引DnaB-DnaC复合物进入局部解链区，形成引发前体复合物。

引发前体复合物中的DnaB蛋白是解旋酶，在ATP参与下将双螺旋DNA链进一步打开。DnaC蛋白辅助解旋酶打开双链。DNA拓扑异构酶防止打结现象。双链解开后，单链DNA 结合蛋白结合到开放的单链上，起稳定和保护单链模板的作用（见图10－16）。

高度解链的模板与蛋白质的复合体促进引物酶（DnaG）加入进来，形成的复合物共有解旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始复制区域，这样的一个复合结构称为引发体（primosome）。然后引物酶以4种NTP为原料，以解开的DNA链为模板，按5?→3?方向合成RNA引物，引物长度为十数个或数十个核苷酸不等，引物上有游离的3?-OH，成为进一步合成DNA的起点。引物合成后，复制叉的形状就已初步具备（见图10－17）。

由DNA聚合酶Ⅲ的β亚基辨认引物，在DNA聚合酶Ⅲ催化下将第一个脱氧核苷酸加到引物的3?-OH上，形成磷酸二酯键，新DNA链的合成即已开始。

二、复制的延长（elongation of replication） （一）复制延长的生化过程

DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合于新DNA链3?末端，可使复制得以延长。具体的化学反应前已述及，新链只能从5?端向3?端延长。

（二）复制的半不连续性和冈崎片段（semidisconuous of replication and Okazaki fragment ）

在形成双螺旋结构时，DNA双链的走向是相反的。一链是5'至3'方向，其互补链是3?至5?方向。复制经解链后，两股单链在复制叉上也是走向相反。复制，包括引物合成，只能从5?向3?延伸（见图10－18）。

如前所述，领头链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以DNA复制是半不连续复制。

1968年，在美国的日本科学家冈崎用电子显微镜及放射自显影技

术，观察到DNA复制过程出现的上述不连续复制现象。后人证实了不连续片段只存在于同一复制叉上其中一股链，即随从链上，因此把复制过程中随从链上的不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在原核生物在一至二千核苷酸范围。每一个不连续复制的片段5?端都带有一个RNA引物。片段的复制完成后，RNA引物会被除去而代之以DNA片段，因此复制至最后，两股子链都是DNA 链。

三、复制的终止（termination of replication）

原核生物的复制终止：原核生物的环状DNA多采用双向复制的方式。某些原核生物，例如猿猴病毒SV40，复制的起始点和终止点刚好把环状DNA分为两个半圆，两个方向各进行180°，同时在终止点汇合。另一些生物两个方向并不是等速的。为了定位方便，习惯把E.coli的DNA分为100等分。E.coli复制起始点oriC在82位点，复制终点ter（termination）在32位点。

由于复制不连续而生成的许多冈崎片段，其5'起点是RNA而不是DNA，所以复制还包括去掉这些RNA引物并换成DNA，最后把DNA片段连接成完整的新链。此时DNA聚合酶Ⅰ发挥它的5?→3?核酸外切酶的活性水解RNA。RNA水解后，留下片段与片段之间的空隙（gap），由DNA聚合酶Ⅰ而不是DNA聚合酶Ⅲ来催化而填补，此时DNA聚合酶Ⅰ发挥它的5?→3?聚合酶活性，也是从5?向3?端用dNTP为原料生成DNA链的。复制片段的空隙，由前方复制的片段提供3?-OH使之延长。这样，直至模板链指引下把空隙填满，亦即由DNA 聚合酶Ⅰ催化延长的链3'-OH 末端到达了复制片段除去引物后的DNA5?-P末端。这两个末端都是游离的，是一个缺口（nick）。这个缺口的连接，需要DNA连接酶，而且是个耗能过程（见图10－19）。

二、真核生物的DNA生物合成 biosynthesis of eukaryotic DNA

真核生物细胞的时相变化称为细胞周期。典型的细胞周期分为4期，即G1、S、G2和

M期，其中S期为DNA合成期（图10-20）。

真核生物的DNA复制过程也可分为复制的起始、延长和终止。但

真核生物DNA分子远比原核生物DNA大，而且DNA通常与组蛋白形成核小体，最后以染色体形式存在于细胞核中，因此真核生物DNA复制和原核生物DNA复制有以下几个方面的不同：

1.真核生物DNA呈线性分布在许多染色体上，每个染色体有上千个复制子，复制的起始点很多，可以从多个起始点同时进行复制。

2.真核生物DNA复制延长中起主要作用的DNA聚合酶为DNA-polα及DNApolδ。DNApol α具有引物酶的活性，催化引物的合成。DNA-polδ具有催化新链延长的作用。此外还需要拓扑酶和复制因子以及增殖细胞核抗原（proliferatioin cell nuclear antigen,PCNA）的参入。

3.真核生物是以复制子为单位各自进行复制的，引物和随从链的岗崎片段都比原核生物的短。真核生物的引物除RNA外，还有DNA片段作为组成成分。

4.真核细胞在复制时，还同步合成组蛋白，进一步形成核小体。 5.真核生物DNA链延伸速度比原核生物慢，但由于形成多个复制单位，故总速度仍很快。

6. 与细菌环状染色体不同，真核生物染色体是线性的。线性DNA复制时，随从链合成的各片段去除引物后，由DNA聚合酶来填补空隙；领头链合成的引物去除后，也要填补空隙。但是，由于DNA聚合酶不能催化3?→5?合成反应，以至于线性DNA末端的空隙无法补充，这样会造成染色体DNA链逐渐地缩短。但事实并非如此，这是因为真核生物线性染色体的末端有一种特殊结构，称为端粒（telomere），又称端区。在端粒酶（telomerase）的参与下，端区具有特殊复制机制，确保染色体DNA复制的完整。

端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的一种特殊结构。（见图10－22）端粒的结构特点为：①由末端单链DNA序列和蛋白质构成；②末端DNA序列是多次重复的富含G、C 碱基的短序列。端粒的这种特殊结构是由端粒酶催化合成的。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的酶。在端粒合成过程中，端粒酶以其自身携带的RNA为模板合成互补链。故端粒酶可看作是一种特殊的逆转录酶。端粒酶在DNA复

制中的功能：复制终止时，染色体线性DNA末端确有可能缩短，但通过端粒酶的作用，可以补偿这种由除去引物引起的末端缩短。

端粒DNA合成过程可分为三个步骤：①端粒酶借助其RNA与DNA单链有互补碱基序列而辨认结合到DNA的末端；②端粒酶以RNA为模板，以dGTP和dTTP为原料在染色体DNA末端进行聚合反应；③伸长的DNA末端与RNA模板配对解开，端粒酶重新定位于模板的3?部位，开始下一轮的聚合作用。经过多次移位、聚合的重复循环，直至端粒的TG链合成达一定长度后终止。人们把端粒的这种合成方式称为爬行模型（inchworn model）（见图10－23）。至于端粒的CA链如何合成目前尚不清楚，有一种解释为：端粒的TG链合成达一定长度后可以自身反折，形成特殊的G-G碱基配对，从而为CA链的合成提供了引物，这样也可以按5?→3?方向合成端粒的CA链。

第四节逆转录和其他复制方式

Reverse transcription and other manner of replication 逆转录（Reverse transcription）：

以RNA为模板，在逆转录酶的催化下合成与其互补的DNA的过程。逆转录酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶。最早在逆转录病毒细胞内发现了逆转录现象。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传物质的传代与表达功能。分子生物学研究可应用逆转录酶，合成DNA。以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链，称为cDNA (complementary DNA)（见图10－24）。

滚环复制和D环复制（rolling -loop replication and D-loop replication）

滚环复制是某些低等生物的复制形式。滚环复制时，由具有核酸内切酶的A蛋白在复制起始点打开一个缺口，形成有3'-OH和5'-P的开环单链。复制不需要引物而在开链的3'-OH延伸，保持闭环的对应单链为模板，一边滚动一边进行连续的复制。滚动的同时，外环5'端逐渐离环向外伸出（图10-25）。完成一次复制后，A蛋白把母链和子链切断，外环母链再重新滚动一次，3'-端沿母链延长，最后合成两个子双环。

用于DNA序列测定的M13噬菌体，感染型是DNA单链，感染Ecoli后M13在细胞内复制也是滚环复制。

D环复制是线粒体DNA的复制形式。复制时需要合成引物。线粒体DNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制（图10-26）。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内外环复制有时序差别。

第五节DNA损伤（突变）与修复 DNA damage and repairing

遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变（mutation）。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。而在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤（DNA damage）。

一、突变的意义

（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变

这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。

（三）突变导致死亡

（四）突变是某些疾病的发病基础：如遗传病、肿瘤和有遗传倾向的病。

二、引发突变的因素

生活环境中导致突变的因素主要有物理和化学因素。物理因素主要指紫外线和各种辐射。紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体，导致突变的发生（图10－27）。化学因素主要指化学诱变剂。

三、突变的分子改变类型 （一）错配（mismatch）

DNA分子上的碱基错配又称为点突变（point mutation）指DNA分子上一个碱基的变异。有转换和颠换两种形式，转换发生在同

型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。颠换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。点突变如发生在基因的编码区域，可导致氨基酸的改变，引起疾病，如镰形红细胞贫血。镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS，与正常成人Hb（HbA）比较，只是β链上第6号氨基酸的变异，而基因上的改变仅是为第6号氨基酸编码的密码子上的一个点突变（见图10－28）。

（二）缺失（deletion）、插入( insertion )和框移

缺失指一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入指一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变（frame-shift mutation）。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同（见图10－29和30）。

（三）重排（rearrangement）

DNA分子内发生较大片断的交换，也称为重组。例如由基因重排引起的两种地中海贫血基因型（见图10－31）。

四、DNA损伤的修复（repairing of DNA damages）

修复（DNA repairing）是针对已发生了的缺陷而进行的补救机制，主要有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复等。

（一）光修复（light repairing）

光修复过程通过光修复酶催化完成，光修复酶可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，DNA完全恢复正常（见图10－27）。

（二）切除修复（excission repairing）

是细胞内最重要的修复机制，主要由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶完成。例如E.coli的切除修复机制。其基本机制是通过特异的核酸内切酶水解核酸链内损伤部位的5′端和3′端的磷酸二酯键，在链内造成一个缺口。当错误的核苷酸从链上水解出来后，再由DNA聚合酶I的催化作用，按照模板的正确配对，按5′至3′方向补回空隙。最后，由DNA连接酶把最后的3′-OH与5′-P裂口接成磷酸二酯键，完成切除修复的过程（见图10－32）。

（三）重组修复（recombination repairing）

当DNA分子的损伤面较大，还来不及修复完善就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，这时，就靠重组蛋白RecA的核酸酶活性将另一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。而健康母链又出现了缺口，但它仍有健康的模板，借助DNA聚合酶I及DNA连接酶的作用，可以将健康链完全复原。但损伤链的损伤可能会长期保留下去。但在以后不断的复制过程中，损伤链所占比例就越来越低，即把损伤链“稀释”掉（见图10－33）。

（四）SOS修复（SOS repairing）

SOS修复是当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。这时各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子（regulon）的网络式系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。即使修复后复制能继续，DNA保留的错误较多，会引起较广泛、长期的突变。