荧光定量PCR完全攻略

荧光定量PCR完全攻略

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1、什么是定量PCR?

以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中

靶基因的拷贝数,称为定量PCR.定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的.

2、定量PCR定量的理论依据是什么?

特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,

则无论原来样品中起始模板含量多少,最终扩增片段的含量通常是一样的. 理想的扩增结

果:Y=X*2n

其中Y代表扩增产物量, X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数; 理

论上PCR扩增效率为 100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一

次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈 2 的倍增长;实际应为:Y= X(1+E)n

,其中E 代表扩增效率:E = 参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是

固定不变的.通常X 在1~105 拷贝、循环次数n≤30 时,E 相对稳定,原始模板以相对固

定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30

次),E值逐渐减少,Y 呈非固定的指数形式增加,最后进入平台期.

3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么?

PCR 是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰 PCR 指数扩增的因素都会影响扩

增产物的量,使得 PCR 扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通

过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量.近年来研究人员通过大量的实践,研究了

相对准确的定量 PCR 方法,即荧光定量 PCR.

PCR扩增通式: ① Tn=T0(1+E)n

② Tn=Tn-1(1+E)n

注:[0其中E表示扩增效率,n为循环数,Tn表示在n个周期后PCR产物的数量,Tn-1表示在n-1 个周

期后PCR产物的数量,T0为原始模板数量.设定PCR到达指数扩增期时,产生一定的荧光(荧

光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K,为常数,大约在 1010

左右)高于背

景为仪器所识别,此时的循环数为CP(crossing point),也就是K= T0(1+E)CP

,取对数即:

lg K=lg T0+CP*lg(1+E)

CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)

由于对一特定的PCR而言,E与K均为常数,故上式为循环数(CP)对原始模板拷贝数的对

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数(lg T0)一次方程,其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为- 1/lg(1+E),在横坐标上的截距为

lgk/lg(1+E),也是荧光定量PCR所谓的标准曲线.例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标

准曲线:

目前荧光定量 PCR 均采用外标定量

外标法定量PCR扩增效率的计算,由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E),可知

E=10-1/Slope

-1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3.337

-1=0.99,也有作

者将(1+E)直接视为扩增效率E,则E=10-1/Slope

,求得的E值均在 1—2 之间,有时也有大于 2

的结果,如下图所示.另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分

析扩增效率的高低,例如系列 10 倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2

, N3=(10*N0)En3

,在扩

增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同,即N2=N3,En2-n3

=10,取对数得到

⊿n gE=1, E=10l 1/⊿n

,E=2,⊿n=3.32; E=1.8,⊿n=3.91.反之亦然.如图所示.

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4、定量 PCR

根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,定量 PCR 可分为四种

方法:

①有限稀释法,即倍比稀释法:通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止,来设置已知

浓度的参照品;根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线,计算出待检

标本中原始模板的分子数;利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点 A、PCR 产物的

最低可检测极限须有重复性;B、对每个稀释度必须作多次 PCR ,一般先对模板 DNA 作10

倍连续稀释后作 PCR,首先找到 PCR 结果呈阴性的接近稀释点 ,然后再对各稀释度作系列

的2倍稀释,每个稀释点作 5 次PCR;C、必须严格控制污染 .优点:不需要特殊设备;缺点:扩增反应条件的标准化、严格注意污染,避免假阳性的产生.

②使用外参照物的定量 PCR,以已知浓度的目的基因为模板,按一定的倍比稀释,然后做出

标准曲线图,未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数.荧光定量 PCR 通常使用该法做

标准曲线.

③使用非竞争性内参照物的定量:PCR 反应条件同样,在同一试管内,用两对引物,同步扩

增来自同一 DNA 的一段靶序列和另一段内标序列.通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列

定量.方法: A、 设计并合成 PCR 扩增靶基因及无关基因的引物,优化引物配比的条件.B、

在指数增长期实现对靶基因及一系列已知含量无关基因的 PCR 扩增. C、 PCR 产物琼脂糖

凝胶电泳,EB 染色. D、 电泳条带的紫外光下分析. E、 二者荧光强度相等管的 DNA 含

量亦相等. 该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时,才能对两者相对定量;也

可以分成哪几类?

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是对处于扩增指数期的 PCR 产物定量.

④使用竞争性内参照物的定量 PCR:同样的反应条件,同一个试管,用同一对引物,同步扩

增靶序列和内参照序列.靶基因的量可通

基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增,两序列的初始化比值在

整个反应过程中保持不变. 目的 DNA 内参照 DNA 变性(同一对引物) PCR 竞争性模板的

设置:通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的性酶切位点或使原来的

酶切位点缺失通过基因重组技术插入一个与特异性蛋白结合的 DNA 片段,或者使靶序列发生

定点诱变人工合成竞争性模板 竞争性模板设计目的:使其与靶基因的 PCR 扩增产物相区别

(通过酶切、杂交、显色等手段实现).

根据 PCR 扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及最后检测的信号的不同可分

为四种类型:

①直接定量检测法,

②同位素标记定量

③酶标记定量检测法

④荧光定量 PCR 技术

荧光定量 PCR 主要原理

发射波长与受体荧光染料

光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光,同时将供体荧光淬灭.

依据 PCR 过程的监测检测模式又可分为如下几种

(1) Sybr Green I 检测模式

SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光

大增强.因此, SYBR Green I 的

检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量.SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm,发射波

长最大约为 520nm.PCR 扩增程序一般为 94℃~55℃~72℃三步法,40 个循环.

SYBR Green I 的缺点:由于 SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链

就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本

所以在临床上使用可能会有假阳性发生.

SYBR Green I 的优点:SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链 DNA

相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的

这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍.

过与产生相同产物的竞争物的量相比较而得到.其

检测法,

:荧光共振能量转移,外来光源激发供体荧光染料发出荧光,当其

的吸收波长部分重叠,且两者距离很近(约10~100 埃)时,受体荧

染料.其与双链 DNA 结合后, 荧光大

荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关,可以根据荧光信号

底较高,

特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低.

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SYBR GREEN I 工作原理

(2) 水解探针模式(Taqman)

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针 '末端, 而淬灭剂则在 3'末端.当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与 3'端的淬灭剂接近而被淬灭.在进

行延伸反应时,聚合酶的 5'外切酶活性将探针切断, 使得荧光基团与淬灭剂分离,发射

荧光.一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生.随着扩增循环数的增加,释放

出来的荧光基团不断积累.因此 Taqman 探针检测的是积累荧光.PCR 扩增程序通常是:94℃~

60 ℃ 40 个循环.常用的荧光基团是 FAM,TET,VIC,HEX.

Taqman 探针工作原理

(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)

分子信标是一种呈发夹结构的茎环 因此标

记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近.荧光基团被激发后产生的光子被

,荧光基团连接在探针的 5

双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,

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淬灭剂淬灭,由荧光基团产生的能量以红

构中,环一般为 15-30 个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般 5-7 个核苷酸长,并相互

配对形成茎的结构.荧光基团标记在探针的一端,而淬灭剂则标记在另一端.在复性温度下,

因为模板不存在时形成茎环结构,当加热变性会互补配对的茎环双链解开,如果有模板存在

环序列将与模板配对.与模板配对后,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与淬灭

剂分开.当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除,发出激发光子.由于是酶切作用的存在,

分子信标也是积累荧光.常用的荧光基团:FAM ,Texas Red .PCR 扩增程序通常是:94~

55~72 ℃三步法,40 个循环.

外而不是可见光形式释放出来.分子信标的茎环结

ET 探针又称双杂交探针,FRET 探针由两条相邻探针组成,在一条探针的 5`端标记 FAM 荧

光基团,另一探针的 3`端标记 Red 0 荧光基团.当复性时,探针结合在模板上,FAM 基团

和Red0 基团相邻,激发 FAM 产生的荧光,作为 Red0 基团的激发光被吸收,使Red0

分子信标工作原理

FR

发出波长为 0 的荧光.当变性时,探针游离,两基团距离远,不能产生 0 波长的荧光.

由于 FRET 探针是靠近发光,所以检测信号是实时信号,非累积信号.常用的荧光基团是:

LC-Red0,LC-Red705.

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FRET 工作原理

能用于实时荧光 PCR 定量的方法很多,各有优缺点,应根据实验的需要和当前的实验条件选

择适合自己的方法.

SYBR GREEN FRET 探针 Taqman 分子信标

性质可逆荧光 积累荧光

熔点分析 能 不能

特异性

引物(非特异性扩

增或引物二聚体有

影响)

引物+2 探针 引物+探针 引物+探针

探针不需要 需要 需要 需要

通用性 通用 专用 专用 专用

5、为什么要用荧光定量 PCR 技术进行定量?它与传统的定量 PCR 有什么不同?

如前所述的,传统的定量 PCR 有很多,主要是倍比稀释法、内参照法、竞争法、PCR-ELISA

法,但这些定量 PCR 技术的难点主要在于:(1)如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内(只

有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例).(2)一旦线性扩增范围确定

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以后,如何找到一个合适的方法检测结果.为了保证线性,研究者要扩增一系列梯度稀释的

cDNA 或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整;有的研究者加一个竞争性模板,有的做

性的稀释梯度分析,或者加一个 PCR 模拟(mimic)反应,即用相似的引物与目标产物

共扩增,而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、放射活性或者探针进行检测.(3)

大多数是终点检测,即PCR 到达平台期后进行检测,而PCR 经过对数期扩增到达平台期时,

检测重现性极差.同一个模板在 96 孔PCR 仪上做 96 次重复实验,所得结果有很大差异(如

下图所示),因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量;虽然加入内标后,可部分消除

终产物定量所造成的不准确性.但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定

量的方法,所以传统定量 PCR 的缺点是:劳动强度大、定量不准确、重复性差.

而荧光定量PCR有如下显著的优点:

1、特异性好,使用特异性探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性.同时,靶序列由

引物和探针双重控制,特异性好、假阳性低.

2、灵敏度高,荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象

技术为一体的技术,因此它的检测灵敏度很高.

3、线性关系好、线性范围宽,由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通

过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量;定量范围可在 0-1010

拷贝/毫升.

4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染.扩增和检测可以在同一管内检测,不需要开

盖,不易污染;同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理,不再需要担心放射性污染.