２０１５年１０月 中成药 Ｏｃｔｏｈｅｒ ２０１５ 第３７卷第１０期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏ１．３７ Ｎｏ．１０ 三七中总皂苷闪式提取工艺 冯素香， 史晶晶， 吴兆宇， 周悌强， 李建生， 王蒙蒙， 郝 蕊， 李 先 （河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州４５００４６） 摘要：目的 比较闪式提取法和回流提取法对三七总皂苷提取率。方法以三七提取物的出膏率和三七总皂苷含有量 的综合评分为考察指标，采用正交试验法对提取的结果进行比较。结果 闪式提取的最佳工艺为１２倍量７０％乙醇， 提取１ ｍｉｎ。结论闪式提取法所得三七总皂苷的量高于回流提取法，而且操作简便、高效、提取率高。 关键词：三七总皂苷；闪式提取；回流提取；正交试验 中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１—１５２８（２０１５）１０－２１７７－０４ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—１５２８．２０１５．１０．０１６ Ｓｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ ｅｔ Ｒｈｉｚｏｍａ ＦＥＮＧ Ｓｕ—ｘｉａｎｇ， ＳＨＩ Ｊｉｎｇ－ｊｉｎｇ， ＷＵ Ｚｈａｏ—ｙｕ， ＺＨＯＵ Ｔｉ—ｑｉａｎｇ，Ｌ１ Ｊｉａｎ—ｓｈｅｎｇ， ＷＡＮＧ Ｍｅｎｇ— ｍｅｎｇ，ＨＡＯ Ｒｕｉ，ＬＩ Ｘｉａｎ （Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ＆Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００４６，Ｃｈｉｎａ） ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ ｅｔ Ｒｈｉｚｏｍａ；ｓｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｒｅｆｌｕｘ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ 三七（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ ｅｔ Ｒｈｉｚｏｍａ）为五加 优化，用以探讨不同提取方法对三七总皂苷提取率 科植物三七的干燥根和茎，又名田七、金不换等， 的影响，为其提取提供新方法。 是我国名贵的传统中药。其性温，味甘、微苦，归 １材料 肝、胃经，含皂苷、多糖等有效成分，有散瘀止 ＪＨＢＥ－５０闪式提取器（河南金鼎科技发展有限 血、消肿定痛之功效，用于治疗咯血、崩漏、外伤 公司）；Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５ ＨＰＬＣ色谱仪，包括Ｗａｔｅｒｓ 出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等…，其中三七皂苷 ２９９８紫外检测器、Ｅｍｐｏｗｅｒ色谱工作站（美国 是主要有效成分。现代药理研究表明，该成分能改 Ｗａｔｅｒ公司）；ＫＨ２２００ＤＢ超声波清洗器（昆山市 善脑缺血后脑组织的能量代谢 Ｊ、抗帕金森病等 超声仪器有限公司）；ＸＳ１０５电子分析天平（瑞士 神经系统疾病、抗肾问质纤维化 Ｊ、抗糖尿病肾 梅特勒一托利多公司）；ＳＨＥ．Ｄ（ＩＩＩ）循环水式真空 病，抗肾小球纤维化等泌尿系统疾病、抗肝纤维化 泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。 等作用 Ｊ。目前，三七的提取方法有渗漉法 Ｊ、 三七皂苷Ｒ （批号１１０７４５－２００６１７）、人参皂 醇回流提取法、超声提取法 ６ 等，而最近又有闪 苷Ｒｇ （批号１１０７０３－２０１１２８）、人参皂苷Ｒｅ（批 式提取法对三七有效成分进行研究的报道 剖，但 号１１０７５４－２００４２１）、人参皂苷Ｒｂ （批号１１０７０４— 尚未将该方法应用于三七总皂苷。闪式提取法是一 ２０１２２３）、人参皂苷Ｒｄ（批号１１１８１８—２０１００１）对 种在常温下快速提取的方法，具有高效、节能等特 照品（中国食品药品检定研究院）。乙腈为色谱纯 点，本实验以三七提取物中三七皂苷Ｒ 和人参皂 （美国Ｆｉｓｈｅｒ公司）；水为超纯水（自制）。三七饮 苷Ｒｇ 、Ｒｅ、Ｒｂ 、Ｒｄ这五种皂苷含有量的总和作 片购自河南张仲景大药房股份有限公司，由河南中 为总皂苷含有量，以三七提取物的出膏率和总皂苷 医学院药学院陈随清教授鉴定为五加科植物三七 含有量为指标，采用正交试验设计，对该方法进行 Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ（Ｂｕｒｋ．）Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ的干燥根。 收稿日期：２０１５４）１．３０ 作者简介：冯素香（１９７１一），女，副教授，硕士生导师，从事中药质量分析与新药研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｓｘ２２１＠１６３．ＣＯＢ ２１７７ ２０１５年１０月 中成药 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ０ｃｔｏｂｅｒ ２０１５ 第３７卷第ｌ０期 Ｖ０ｉ．３７ Ｎｏ．１０ ２方法与结果 ２．１ 三七提取物中总皂苷的ＨＰＬＣ测定 （４．６ ｍｉｌｌ×２５０ ｍｍ，５ ｔｘｍ）；流动相为水（Ａ）一乙 腈（Ｂ），梯度洗脱０—１２ ｍｉｎ一６０ ｎ一７０ ｍｉｎ， ８１％Ａ－－－，８１％Ａ一６４％Ａ一８１％Ａ ；检测波长 ２０３ ｌ＇ｌｍ；进样量１０ ｔｘＬ；柱温２５℃，三七混合对 ２．１．１ 供试品溶液的制备精密称取三七提取物 ２０ ｍｇ，置１０ ｍＬ量瓶中，加７０％甲醇溶解并稀释 至刻度，摇匀，０．４５ ｍ微孔滤膜过滤，即得。 照品及供试品色谱图见图１。 ２．１．２ 色谱条件 Ｖｅｎｕｓｉｌ ＸＢＰ—Ｃ 色谱柱 ２０ ２０ ．１５ １５ １０ １０ ０５ ０５ Ｏ ＯＯ ０ ２０ ． ４Ｏ ６Ｏ Ｏ ＯＯ ０ ２０ ４０ Ａ对照品ｔ／ｍ Ｂ供试品 １．三七皂苷Ｒ１ ２．人参皂苷Ｒｇ１ ３．人参皂苷Ｒｅ ４．人参皂苷Ｒｂ１ ５．人参皂苷Ｒｄ １．ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒ１ ２．ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｇ１ ３．ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｅ ４．ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ１ ５．ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｄ 图１ ＨＰＬＣ色谱图 Ｆｉｇ．１ ｍｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ２．１．３标准曲线精密称取三七皂苷Ｒ 、人参皂 ８、１２、２４ ｈ进样测定，记录峰面积ＲＳＤ。结果， 三七皂苷Ｒ 、人参皂苷Ｒｇ 、Ｒｅ、Ｒｂ 、Ｒｄ的 苷Ｒｇ 、Ｒｅ、Ｒｈ 及Ｒｄ对照品适量，加甲醇溶解， 制成质量浓度分别为０．１７４、０．５１２、０．１０５、 ０．４４６、０．１５１ ｍｇ／ｍＬ的混合对照品溶液。然后， 精密量取０．５、１、２、４、５、１０ ｍＬ，分别置于ｌ０ ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀。在 “２．１．２”项色谱条件下进行测定，以进样量 （ｍｇ／ｍＥ）为横坐标（ ），峰面积为纵坐标（Ｙ） 绘制标准曲线，得到各组分的回归方程，见表１。 表１各组分标准曲线 Ｔａｂ．１ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ＲＳＤ值分别为１．６１％、１．５３％、１．３９％、１．８６％ 和１．０９％，说明对照品溶液在常温下２４ ｈ内稳定。 ２．１．６重复性试验 精密称取提取物６份，按 “２．１．１”项下方法制备供试品溶液，并在“２．１．２” 项色谱条件下测定。结果，以上５种皂苷含有量的 ＲＳＤ值分别为１．４１％、０．９４％、１．７６％、１．３５％和 １．８３％，表明该方法重复性良好。 ２．１．７ 加样回收率实验线性范 精密称取三七皂苷质量 分数已知的提取物样品６份，每份１０ ｍｇ，分别精 密加入混合对照品溶液（三七皂苷Ｒ 、人参皂苷 Ｒｇ 、Ｒｅ、Ｒｂ 、Ｒｄ的质量浓度分别为０．５６９、 ２．９４７、０．４３２、１．９２５、０．７１１ ｍｇ／ｍＬ）１ ｍＬ，加 皂苷 回归方程 相关系数 甲醇溶解，定容于１０ ｍＬ量瓶中，制备供试品溶 液，并在“２．１．２”项色谱条件下测定。结果，三 七皂苷Ｒ 、人参皂苷Ｒｇｈ Ｒｅ、Ｒｂ 、Ｒｄ的平均 ２．１．４精密度试验精密吸取“２．１．３”项下混 加样回收率分别为１００．１％、９８．７％、９９．７％、 ９８．９％、９９．７％，ＲＳＤ值分别为１．８９％、１．０３％、 ０．８９％、１．９８％、１．０２％，表明该方法回收率 良好。 合对照品溶液适量，在“２．１．２”项色谱条件下重 复进样６次进行测定，每次ｌ０ Ｌ，记录峰面积 ＲＳＤ。结果，三七皂苷Ｒ 、人参皂苷Ｒｇ 、Ｒｅ、 Ｒｂ 和Ｒｄ的ＲＳＤ值分别为１．３１％、１．５４％、 １．２９％、１．６３％和１．４０％，表明仪器精密度良好。 ２．１．５稳定性试验一２．２ 试验设计 称取三七药材粗粉适量，按 Ｌ （３ ）正交表，选取乙醇体积分数（Ａ）、物料比 （Ｂ）和提取时问（Ｃ）为考察因素，在１２０ Ｖ电压 下进行闪式提取，以三七总皂苷的含有量和出膏率 精密吸取“２．１．３”项下同 对照品溶液适量，分别于配制后０、２、４、６、 ２１７Ｒ ２０１５年１０月 中成药 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ０ｃｔｏｂｅｒ ２０１５ Ｖ０１．３７ ＮＯ．１０ 第３７卷第１０期 为考察指标，进行正交试验，因素水平见表２。然 后，再称取三七药材适量，在１２０ Ｖ电压下闪式提 表３正交试验设计与结果 Ｔａｂ．３ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 取２次，合并滤液，浓缩至无醇味，用等体积石油 醚萃取２次，收集下层水液，水浴中挥去石油醚， 水液用等体积水饱和正丁醇萃取数次，至正丁醇层 无色，水浴中挥至无正丁醇味，冷冻干燥，即得三 七总皂苷提取物。 表２因素水平 Ｔａｂ．２ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ 表４综合评分方差分析 Ｔａｂ．４ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｆ ２．３正交试验方案及结果根据Ｌ。（３ ）表安排 实验，测定提取物中总皂苷的含有量和出膏率，以 上述两个指标的综合评分对结果进行方差分析，见 表３和表４。设定满分为１００，权重系数分别为０．７ 和０．３，计算公式为综合评分＝（０．７ ｘ Ｘ／Ｘ × １００＋０．３×Ｙ／Ｙｍ ）×１００％，其中 为提取物中 总皂苷含有量，ｙ为出膏率 。由表４可知，因 素Ａ和Ｂ对结果均有非常显著的差异（Ｐ＜０．Ｏ１）， 三个因素的影响大／ｌ＇，Ｊｌ￣序是乙醇体积分数＞料液比 注：Ｆ０ ｏ５（２，２）：１９；Ｆ０ ｎ１（２，２）＝９９； ＜Ｏ．Ｏ１ 表５闪式提取优化工艺验证试验 Ｔａｂ．５ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｖｅｒｉｆｙｉｎｇ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘ－ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ＞提取时间。综合以上分析结果，优选出三七总皂 苷的闪提最佳工艺是Ａ Ｂ Ｃ ，即加１２倍量７０％乙 醇，闪式提取１ ｒａｉｎ。 设计乙醇回流提取三七总皂苷的最优工艺，即 ７０％乙醇回流提取两次，每次２ ｈ，物料比１：１０， 结果见表６。由表可知，闪式提取法所得三七总皂 苷的量远高于回流提取法，而且提取物的出膏率也 略高于后者，表明闪式提取法提取总皂苷的量高于 根据文献［１１—１２］， 回流提取法。 ２．４验证试验为验证正交设计试验中最优工艺 的重复性和可靠性，用闪式提取最优工艺提取三 七，平行３份，结果见表５，可见其可靠性和重复 性良好。 ２．５两种提取方法的比较表６闪式提取法和回流提取法的比较（ ±Ｓ。ｎ＝３） Ｔａｂ．６ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｍａｓｈｉｎｇ ｉｔｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｌｕｘ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ（ ±Ｓ，ｎ＝３） 注：提取率＝（总皂苷提取量／药材中总皂苷量）×１００％ ３讨论 ３．２流动相的考察本实验采用闪 本实验通过对不同流动相比 ３．１三七总皂苷提取工艺的比较例和梯度进行考察，发现以水（Ａ）一乙腈（Ｂ） 式提取法，对三七提取物中三七皂苷Ｒ 和人参皂 梯度洗脱（８１％Ａ一８１％Ａ一６４％Ａ一８１％Ａ，相应 时间周期为０—１２ ｍｉｎ一６０ ｍｉｎ一７０ ｒａｉｎ）时，色 苷Ｒｇ 、Ｒｅ、Ｒｂ 、Ｒｄ进行研究，得出最佳工艺， 即加１２倍量７０％乙醇，提取１ ｍｉｎ。同时，与回 流提取法进行对比，发现闪式提取法所得三七总皂 谱峰的峰形及分离度均良好，而且保留时间适宜。 闪式提取法的主要原理是通过高速机械力对植 物组织进行破坏，使有效成分迅速溶出转移，从而 苷的含有量高于回流提取法，而且提取效率较高。 ２０１５年１０月 第３７卷第１０期 中成药 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５ ＶｏＩ＿３７ Ｎｏ．１０ 达到有效成分快速提取的目的 。 。研究表 取工艺研究［Ｊ］．药物评价研究，２０１３，３６（２）：１３５—１３７． ［８］ 周 湛，刘延泽．三七芦头和根须总皂苷的闪式提取及纯 化工艺研究［Ｊ］．中国现代中药，２００９，１１（３）：３４－３６． ［９］ 胡晓燕，刘桥春，孙明 。 ，它较于回流提取等传统方法，具有操作 简便、快速高效等特点。而且，闪式提取法在室温 下操作，可避免高温破坏有效成分，是一种可靠并 琴，等．正交试验法优选板蓝根药材 闪式提取工艺［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１１，３１（２３）： 有发展潜力的提取技术。 参考文献 国家药典委员会．中华人民共和国药典：２０１０年版一部 ［ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０：１１－１２． ［２ Ｊ 黄小平，王蓓，邱咏园，等．黄芪甲苷和三七的主要有效 成分配伍对小鼠脑缺血再灌注后脑组织能量代谢的影响 ［Ｊ］．中草药，２０１４，４５（２）：２２０－２２６． ［３］ 赵宗江，张新雪，张学凯，等．三七总皂苷防治大鼠腺嘌呤 。肾间质纤维化作用的实验研究［Ｊ］．世界科学技术：中医 药现代化，２００８，１０（２）：７４＿７７． ［４］ 姜辉，高家荣，张家富，等．三七总皂苷对肝纤维化大鼠 的保护作用及机制［Ｊ］．中药药理与临床，２０１３，２９（３）： ７１－７３． ［５］ 谭朝阳，尤昭玲，袁宏佳，等．三七渗漉提取工艺的研究 Ⅲ ＿寸 ［Ｊ］．中国中医药信息杂志，２０１０，１７（４）：５１－５２． 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