胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性研究

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·实验研究·胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性研究

牛朝诗，倪永丰，陈建民

（安徽医科大学附属省立医院神经外科安徽省立体定向神经外科研究所，安徽合肥230001）

摘要：目的从人脑胶质母细胞瘤中分离培养脑肿瘤干细胞（braintumorstemcells，BTSC），并研究其生物学特性。方法利用无血清培养基和悬浮培养方法，从6例人胶质母细胞瘤标本中分离培养BTSC，并通过单克隆形成实验观察脑肿瘤干细胞球（brain

tumorsphere，BTS）的形成过程。将BTSC接种于含血清培养基，观察其在体外的分化特点。将BTSC子代分化细胞更换培养条件，

观察其在无血清培养基中的逆向分化现象。应用细胞免疫荧光染色对BTSC及其分化细胞进行鉴定。结果在人胶质母细胞瘤中成功分离出BTSC，其在无血清培养基中呈悬浮球状生长，具有很强的自我更新和增殖能力；免疫荧光显示其表达CD133。BTSC在含血清培养基中发生贴壁分化，分化后的子代细胞可表达CD133、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。

BTSC子代分化细胞在无血清条件下培养，能够再次增殖形成BTS，呈逆向分化现象。结论人胶质母细胞瘤中存在BTSC，其具有

自我更新、无限增殖、多向分化以及逆向分化等生物学特性。

关键词：神经胶质瘤；胶质母细胞瘤；肿瘤干细胞；细胞培养；细胞分化；生物学特性中图分类号：R739.2

文献标志码：A

文章编号：1009-122X（2009）01-0025-04

Isolation,cultureandbiologicalcharacteristicsoftumorstemcellsinhumanbrainglioblastoma

NIUChaoshi,NIYongfeng,CHENJianmin

DepartmentofNeurosurgery,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,AnhuiProvincialInstituteofStereotacticNeurosurgery,Hefei230001,China

Abstract:ObjectiveToisolatebraintumorstemcells(BTSCs)fromhumanglioblastomaandstudytheirbiologicalcharacteristicsinvitro.MethodsBTSCswereisolatedfrom6freshhumanglioblastomaspecimensandculturedinsimplifiedserum-freemediumbynanospheresuspensionculturemethod.Themonoclonalformationexperimentwasperformedtoobservetheformationofbraintumorstemcellspheres.BTSCswereinoculatedontoserum-containingmediumforobservingtheirdifferentiationcharacteristicsandthentheiroffspringcellswereculturedinthesimplifiedserum-freemediumforobservingtheirretrodifferentiation.TheimmunofluorescencestainingofcellswasemployedtoidentifytheBTSCsanddifferentiatedcells.ResultsBTSCswereisolatedsuccessfullyfromhumanglioblastoma,whichpresentedasspheroidandsuspensiongrowthsinsimplifiedserum-freemedium,andhadstrongself-renewalandproliferationcapacitieswiththeexpressionofCD133,andasadhesiondifferentiationintheserum-containingmedium,andthedifferentiatedcellsshowedexpressionsofCD133,neurone-specificenolase(NSE)andglialfibrillaryacidicprotein(GFAP).TheprogenyofBTSCsculturedinsimplifiedserum-freemediumcouldre-proliferateandformBTS,presentingasretrodifferentiation.ConclusionBTSCsexistinginhumanglioblastomahavebiologicalcharacteristicsofself-renewal,indefiniteproliferation,pluripotentdifferentiationandretrodifferentiation.Keywords:glioma;glioblastoma;tumorstemcells;cellculture;celldifferentiation;biologicalcharacteristics

近年来研究证实：在脑肿瘤组织及其细胞系中存在脑肿瘤干细胞（braintumorstemcells，BTSC），其为引发肿瘤并维持脑肿瘤生长和复发的细胞来源，已成为神经外科研究的热点问题之一[1-5]。我们从人脑胶质母细胞瘤组织中成功分离出BTSC，并进行体外培养、鉴定和生物学特性的初步研究，现报告如下。

皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自PeproTech公司；胎牛血清（FBS）、胰酶、Cy3标记的绵羊抗兔IgG均购自Sigma公司；兔抗人CD133抗体购自Abcam公司；兔抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体、兔抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG均购自武汉博士德公司。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1试剂：DMEM-F12、B27购自Gibco公司；表

收稿日期：2008－09－22

基金项目：国家自然科学基金项目（编号：30672166）

作者简介：牛朝诗（1963－），男，安徽太和人，医学博士，安徽医科大学附属省立医院主任医师。研究方向：脑肿瘤，立体定向和功能神经外科

1.1.2仪器：德国HeraeusandLISHEN公司BB16型CO2恒温恒湿培养箱及HF-safe-1200型超净工作台，日本Olympus公司CKX41型倒置相差显微镜及BX51型荧光显微镜和成像系统。

1.1.3材料来源：6例胶质母细胞瘤标本组织取自2007年12月~2008年4月在我院手术的病人，并经病理诊断为胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）。

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1.2实验方法

1.2.1BTSC分离、培养及传代：

观察BTSC子代分化细胞再生成BTS的情况。取再次

参照Singh等[1]的

生成的BTS按前述方法行CD133染色。

悬浮培养法，术中在新鲜肿瘤组织边缘无囊变、坏死、钙化及电凝部位无菌取材，置于简化的无血清培养基中（DMEM-F12，内含2%B27、EGF20μg/L、bFGF

22.1

结果

原代胶质母细胞

BTSC原代培养的生长状况

20μg/L）。修剪去除坏死组织及残余血管，用无血清培养基冲洗3遍，将组织块剪碎，巴斯德吸管反复吹打成单细胞悬液，74μm孔径筛网过滤，取滤过的单细胞悬液行苔酚蓝染色，计数活细胞，以1×105个活细胞／ml密度接种于培养瓶，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。从取材到接种在2h内完成。原代培养5～7d时行第1次换液，以后每3～4d半量换液1次，每7d按1∶2传代。

1.2.2BTSC单克隆形成实验：细胞连续传3代，待培养液干净、细胞克隆球形态较规则后，用0.25%胰酶+机械法分散为单细胞悬液，离心后重悬于无血清培养基，计数并调整细胞密度为1个活细胞/100μl，接种于96孔板，每孔加液100μl，倒置显微镜下观察标记仅含1个细胞的孔，并补加100μl无血清培养基继续培养，动态观察脑肿瘤干细胞球（braintumorsphere，BTS）的形成。细胞培养1周左右，于倒置相差

显微镜下观察，收集克隆增殖的细胞，移至培养瓶中继续培养扩增。用经过克隆筛选后的BTSC进行实验。

瘤细胞接种后，经无血清培养基培养12～24h，观察到多数细胞沉于瓶底，部分细胞贴壁，部分细胞漂浮于培养基中，并可见非特异性聚集现象。12～24h后，显微镜下即可见到大小不一的小细胞团出现，一般由几个至十几个细胞组成，悬浮于培养基中，小的形状不规则，细胞团愈大则愈近似球形或椭圆形，团内细胞呈圆形，大小不一。培养3～5d后，细胞球逐渐增多，可观察到数十个至上百个细胞聚成的BTS，形状规则，呈圆形或卵圆形，结构较致密而不易吹散，折光性较强，晃动培养瓶时可见细胞球滚动，同时培养基变浑、变黄，悬浮单细胞数量及非特异性聚集明显减少，细胞碎屑增多（图1A）。培养7d后，肉眼能看见许多针尖大小的白色漂浮物，镜下可观察到几百个细胞组成的BTS沉于瓶底，生长明显减缓。

2.2BTSC传代培养的生长状况当BTSC生长到7d时，BTS增殖形成数百个细胞直径大小的克隆球，

相差显微镜下折光性不好，中心暗淡，周边的细胞逐渐贴壁分化，甚至伸出突起；要及时传代，否则中心的细胞可能因养分缺乏而凋亡，传代后24h左右，即可见次代BTS形成，以后数量逐渐增多，体积增大，细胞形态与原代无异。连续传3代后，细胞成分相对较纯，

1.2.3BTSC免疫荧光鉴定：传代后第5天，取生长状况良好的BTS重悬于含少量血清的培养基（含10%FBS的DMEM-F12）中，滴于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，静置约4h，待其贴附于玻片，用4%多聚甲醛固定30min，正常山羊血清封闭20min，兔抗人CD133一抗4℃孵育过夜，Cy3标记的绵羊抗兔IgG37℃孵育60min，每步骤间均用0.01mol/L的PBS漂洗3次，每次5min。封片后置荧光显微镜下观察摄片。1.2.4BTSC的诱导分化及免疫荧光鉴定：传代后第5天，取生长状况良好的BTS悬浮于含少量血清

的培养基中，接种到放有盖玻片（经多聚赖氨酸预处理）的6孔板内。更换培养基1次/3d，于倒置相差显微镜下动态观察细胞生长和分化情况。培养10d后取出玻片，按前述方法行CD133、NSE及GFAP染色（后两者染色在血清封闭前用0.3%的TritonX-100处理细胞20min，且二抗选用FITC标记的羊抗兔

BTS形态相对较规则，培养基中单细胞数量及细胞碎

屑较原代明显减少，贴壁细胞逐渐减少，培养基呈清澈透亮（图1B）。

2.3单克隆BTS的形成过程通过有限稀释单克隆

形成实验，在倒置显微镜下可观察到单细胞克隆增殖形成BTS的全过程（图2）。接种后24～48h，即可见单细胞形成2~数个细胞组成的细胞集落，集落内细胞呈圆形，大小相似；48～72h后，可见构成集落的细胞约十几个至数十个；4～5d后，形成数十个至上百个细胞构成的单克隆性细胞球，细胞球呈圆球形或椭圆形，透光度好，结构均一，相对较松散，容易吹打成单细胞，此时可称为BTS，为来源于同一细胞的大量亚细胞系克隆球，因此，非BTSC比例少，纯度高。

IgG）。

1.2.5BTSC子代分化细胞的逆向分化及免疫荧光鉴定：用0.25%胰酶消化收集上述血清诱导分化10d

后的贴壁细胞，离心后重悬于无血清培养基中，计数并调整细胞密度为5个活细胞/100μl，接种于96孔板，每孔加液100μl，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，以后隔日每孔添加20μl无血清培养基，

2.4BTSC的分化将BTS接种于含血清培养基中，4h后可见BTS已贴壁，并向四周伸出小而短的突起；以后突起逐渐延长，同时BTS内细胞亦向四周迁移，

胞体逐渐变大，形态多样，镜下透亮，折光性好。一般

7d后，大部分BTS中心的细胞仍呈未分化状态，细

胞形态较小，未见明显突起，排列紧密并相互堆叠；

BTS周边细胞几乎均分化铺展开来，形成单细胞层。

牛朝诗，等.胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性研究

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相邻球体之间的空隙大多为贴壁细胞所填补，分化细胞呈神经元或胶质细胞样，但形态不典型，细胞核大小形态差异较大，异型性明显（图3）。贴壁细胞数量无明显增加，表明BTSC在含血清条件下增殖受到抑制，表现以分化为主。

增大呈球体状，每个BTS约含100～200个细胞，细胞大小相对均匀。

2.5BTSC子代分化细胞的逆向分化BTSC子代分化细胞再转换到无血清培养基后，24h内大部分细胞发生贴壁，少数细胞悬浮在培养基中；2d后，悬浮细胞中部分细胞增殖形成细胞团；培养3～6d，细胞聚集

成团的现象增多，陆续出现大量悬浮生长的细胞团，最初由十余个细胞构成，随着时间延长，细胞团逐渐

2.6细胞免疫荧光鉴定结果BTS贴壁4h后行CD133染色，细胞膜、细胞质发出红色荧光，表明BTS包含大量表达CD133的BTSC（图4A）。诱导分化10d后行CD133染色，显示少数细胞的细胞膜、细胞质发出红色荧光（图4B）；行NSE、GFAP染色，大多数细胞的细胞质发出绿色荧光，表明大多数BTSC分化成与神经元或胶质细胞相似的肿瘤细胞（图4C，4D）。将逆转增殖所得的BTS行CD133染色，亦呈阳性表

达，显示其已发生逆向分化，恢复干细胞表型。

1A1B2A2B2C2D3图1

4A图3

4B图2

4C4DBTS1A原代培养5d1B第3次传代后5d（倒置相差显微镜400×）

图4

单细胞克隆成球过程2A接种后1h2B接种

后12h2C接种后24h2D接种后3d（倒置相差显微镜400×）BTSC体外分化10d形成的子代细胞（倒置相差显微镜

200×）免疫组织化学染色4ABTSCD133染色呈阳性（Cy3200×）4BBTSC子代分化细胞CD133染色呈阳性（Cy3100×）

4CBTSC子代分化细胞NSE染色呈阳性（FITC200×）4DBTSC子代分化细胞GFAP染色呈阳性（FITC200×）

3讨论

能彻底治愈肿瘤。

胶质母细胞瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤，近年来，尽管手术、放疗、化疗等综合治疗技术不断发展，但其远期预后仍较差。究其原因，主要是对肿瘤起源认识不清，缺乏有效的针对性治疗措施[6]。

传统理论认为，肿瘤生长是所有肿瘤细胞共同增殖的结果。但近年提出的肿瘤干细胞理论则认为，只有少数肿瘤细胞具有无限的增殖能力，它们才是肿瘤发生、发展的关键，而其余的大部分肿瘤细胞只能进行相对有限的增殖和分化。这表明任何治疗方法不能仅针对已分化的肿瘤细胞，只有消灭肿瘤干细胞，才

Singh等[1]和Hemmati等[2]应用无血清悬浮培养方法，从多种神经上皮肿瘤中分离及证实了BTSC的存

在，它具有三大特性：无限增殖、自我更新和多潜能分化。无血清培养基中添加了生长因子等多种物质，以维系BTSC处于未分化状态并促进其增殖，普通肿瘤细胞则大多逐渐凋亡。B27添加剂含有多种神经细胞生长所需的营养物质，是神经干细胞（neuralstemcells，

NSC）培养中最常用的培养基添加剂之一[7]，现已成为培养BTSC无血清培养基的重要成分之一。EGF和bFGF对BTSC具有强大的促有丝性，在BTSC增

殖过程中发挥重要作用。因此，我们从胶质母细胞瘤中

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分离培养BTSC时，在无血清培养基中添加了B27、球的能力[9]。这些异常现象提示BTSC存在分化障碍，不能达到终末分化，未完全失去增殖能力，在一定条件下能逆向分化并回复其干细胞特性。

综上所述，我们从人胶质母细胞瘤中成功分离出

EGF和bFGF等成分，在它们的作用下，BTSC迅速增殖并很快形成了明显的BTS，非特异性聚集和细胞碎屑沉入培养瓶底，连续传代过程中可逐渐清除，第3次传代后培养基已基本清澈，BTS透光性好。在单克隆形成实验中，我们观察到单个BTSC增殖形成BTS的过程，在无血清培养基中BTS体积迅速变大，细胞数量增加，更直观地体现了BTSC的快速增殖特性。

细胞表面标记技术的发展对肿瘤干细胞的鉴定具有重要意义。目前，人们公认的BTSC标记物主要是神经巢蛋白（Nestin）和CD133。Miraglia等[8]发现：同一群肿瘤细胞中，Nestin阳性细胞的比例远远高于

BTSC，体外培养扩增和鉴定证明其具有自我更新、无

限增殖、多向分化及逆向分化等生物学特性。该结果为BTSC的进一步研究奠定了基础。

参

考

文

献

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CD133，这表明Nestin在刚开始分化的前体细胞中已有表达，因而不是可靠的BTSC标记物。CD133在不同系统的干细胞及前体细胞上表达，包括NSC以及

神经前体细胞，而在成熟细胞和较成熟的前体细胞上无表达。Singh等在含生长因子的无血清培养基

[1]

[1]

[7]

中分别培养CD133阳性和阴性脑肿瘤细胞，发现前者具有很强的自我更新和增殖能力，而后者贴壁生长，不增殖，不形成BTS。体内致瘤试验结果表明：

CD133阳性的瘤细胞具有极强的致瘤能力，而阴性者无致瘤能力[3-4]。有鉴于此，CD133是迄今为止发现的BTSC最重要的标记物。

本实验通过检测CD133的表达来判断培养的BTS是否具有干细胞特性，结果显示BTS中绝大多数细胞呈CD133阳性表达，证明了所培养的BTS由具有干细胞特性的BTSC组成。将BTS接种于不含生长因子的含血清培养基中，BTSC很快贴壁分化，分化后的细胞表达神经元特异性标志物———NSE和星形胶质细胞特异性标志物———GFAP，证实了BTSC的多向分化能力。我们还发现：BTSC在含血清培养基中诱导分化后，CD133的表达并未消失；将分化形成的BTSC子代细胞再次接种回添加了生长因子的无血清培养基，能够逆向分化并增殖形成BTS。既往研

究发现，神经干细胞分化后，虽然在分化细胞中存在具有神经干细胞表型的细胞，但不具备再次形成神经

。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。常用统计符号及常见统计学错误：

统计名词和符号请按国家标准《统计学名词和符号》的规定书写：样本数n、算

术平均数x、标准差s、标准误Sx、t检验、F检验、相关系数r、概率P用英文斜体，卡方检验χ２、自由度υ用希文斜体；P值前应给出检验值，如t值，Ｆ值，χ２值等。采用卡方检验方法不能判定数据的有序性质（即资料的优劣高低等），为此，对于单向有序资料可采用秩和检验、Ridit分析，双向有序资料可采用趋势检验等。四格表资料χ２检验公式选择条件：n≥40，且T≥5；n≥40而1≤T＜5时采用校正公式，或计算Fisher精确概率；n＜40或T＜1，直接计算Fisher精确概率。行×列表资料χ２检验的注意事项：各格子T≥1，且1≤T＜5的格子数不宜超过

1/5格子总数，否则可能产生偏性；处理方法有三种：增大样本含量，删去或合并，改用Fisher确切概率法。