临床和实验医学杂志２０１０年１１月 第９卷 第２２期 ・１６８１・ ｍｉＲＮＡ芯片研究大鼠脑创伤后３天皮层 ｍｉＲＮＡ的差异表达 陈芳莲李耀华雷平张建宁（天津医科大学总医院天津市神经病学研究所天津３０００５２） 【摘要】 目的 筛选大鼠脑创伤３ ｄ后皮层差异表达的ｍｉＲＮＡ，为颅脑创伤治疗中的ｍｉＲＮＡ干预策略提供可供选 择的目标ｍｉＲＮＡ。方法将６例创伤后３ ｄ的大鼠大脑皮层组织混匀代袁该组样本，将６例正常对照的大鼠大脑皮层 与正常对照相比，创伤后３ ｄ组共有２５１个ｍｉＲＮＡ表达，其 组织混匀代表该组样本。利用ｍｉＲＮＡ芯片检测伤后３ ｄ的创伤大脑皮层组织与正常对照的差异表达基因。并随机挑 选差异表达基因作定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）验证。结果中，２倍以上差异表达上调的２０个，２倍以上差异表达下调的５个。定量ＰＣＲ验证结果提示芯片结果可信。结论 创 伤大鼠大脑皮层的差异表达ｍｉＲＮＡ在以前的脑创伤文献中鲜有报道，对其干预有望成为颅脑创伤基因治疗的新方向。 【关键词】 大鼠脑创伤ｍｉＲＮＡ芯片 差异表达 Ｓｔｕｄｙ ｏＨ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｉＲＮＡ ｏｆ ｔｒａｕｎｍｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒｕｍ ｃｏｒｔｅｘ ３ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｕｍａ ｂｙ ｍｉＲＮＡ ｇｅｎｅｃｈｉｐ．ＣＨＥＮ Ｆａｎｇ ｌｏｎ，Ｌ１ Ｙａｏ—ｈｕａ，ｉ ，Ｐ ，ｅｔ ｅ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ；ＴｉａＴ￣ｊｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆＰｏｓｏｔ—ｔｒａｕｍａ Ｎｅｕｒｏ—ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｆＥｄｕｃａｔｏｉｏｎ；Ｔｉａｎｊｉｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ 一 ｒｉｅｓ，Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆＮｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００５２，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ａｆｔｅｒ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ（ＴＢＩ）ｉｎ ｒａｔｓ， ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｍｉＲＮＡ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＴＢＩ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｄ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉＲＮＡ ｃｈｉｐ ｉｎ ｃｏｎｔｕｓｅｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ３ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ＴＢＩ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｂｅ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ２５ １ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ（２０ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ５ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｗｉｃｅ）ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ３ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｕｒｙ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｓ ｗｅｌ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｉＲＮＡ ａｆｔｅｒ ＴＢ１ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａ－ ＰＹ ｏｎ ＴＢＩ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｒａｔ；Ｂｒａｉｎ ｔｒａｕｍａ；ＭｉＲＮＡ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 颅脑创伤的伤残率和死亡率占全身各部位损伤的 个标准大气压的压力造成大鼠颅脑冲击损伤。伤后即 首位，各国学者都在努力寻找有效的治疗方法。近年发 刻接小动物呼吸机予以辅助呼吸，确认自主呼吸恢复后 现内源性非编码单链小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）可同时封闭 去除打击管，缝合头皮，将动物放回鼠笼继续喂养。假 多个靶基因的翻译，干预调节ｍｉＲＮＡ可改变多个靶基 手术组动物与实验组动物行相同手术步骤，但不致伤。 因的表达水平，可大大提预效率 。目前，ｍｉＲＮＡ 动物处死后立即断头取脑组织，均严格选取创伤灶 在脑创伤的表达情况报道鲜见。本研究利用ｍｉＲＮＡ芯 边缘水肿区皮层脑组织，显微镜下清除软膜及血管，生 片研究大鼠脑创伤后３ ｄ的皮层ｍｉＲＮＡ表达变化，为颅 理盐水漂洗后立即装入冻存管置液氮罐速冻后再转至 脑创伤治疗中的ｍｉＲＮＡ干预策略提供目标ｍｉＲＮＡ。 ８０℃低温冰箱保存待用。 一１材料和方法 １．２ 主要试剂、仪器 液压颅脑创伤仪（美国ＮＥＷ １．１ 动物分组、模型制作及标本处理 成年Ｗｉｓｔａｒ大 ＳＵＮ公司）；小动物固定仪（自主研制，已申请国家专 鼠１２只（由北京大学医学部动物中心供应），雌雄不拘， 利，２００６１０１２９５８４．８）；Ｔｒｉｚｏｌ试剂和Ｍ—ＭＬＶ逆转录酶 体质量２５０—３００ ｇ，随机分为两组，一组假手术组（不致 （美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；Ｔ４ ＲＮＡ连接酶和低分子质量 伤），另外一组为实验组，伤后３ ｄ，每组６只。１０％水合 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ（美国ＮＥＢ公司）；５ 一（Ｐ）ＣＵ—Ｃｙ３—３ 氯醛腹腔麻醉满意后将动物呈俯卧位头部固定于脑立 ＲＮＡ（美国Ｄｈａｒｍａｃｏｎ公司）；ｍｉＲＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ 体定位仪上，备皮消毒后沿正中线切开头皮及皮下组 ｋｉｔ（１５５０＃）（美国Ａｍｂｉｏｎ公司）；ｍｉｒＶａｎａＴＭｑＲＴ—ＰＣＲ 织，分离骨膜暴露颅骨。致伤部位选择位于右侧顶部皮 ｍｉＲＮＡ检测试剂盒（美国Ａｍｂｉｏｎ公司）；５０ Ｘ ＲＯＸ ｒｅｆ－ 层（紧挨冠状缝后，矢状缝旁２ ｍｍ）。高速磨钻行颅骨 ｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；ＳｍａｒｔＡｒｒａｙＴＭ ４８芯 钻孔，保持硬膜完整，开一直径约３ ｍｍ的圆形骨窗，用 片点样仪、ＬｕｘＳｃａｎＴＭ １０Ｋ—Ａ激光共聚焦芯片扫描仪、 牙科磷酸锌水门汀将打击管严密固定在颅骨骨窗上。 芯片杂交盒、ＢｉｏＭｉｘｅｒＴＭ １Ｉ芯片杂交清洗仪和ＤＮＡ点 再将大鼠头部固定，待大鼠恢复清醒状态后，将打击管 样液（博奥生物公司）；ＬｉｌｆｅｒＳｌｉｐＴＭ杂交盖片（美国Ｅｒｉｅ 注满水，连接到的液压颅脑创伤仪打击口，打开数字存 公司）；ＳｐｏｔＤａｔａＴＭ分析软件（博奥生物公司）；Ｓｉｇｎｉｆｉ— 储示波器准备记录液压冲击波形，松开摆锤，以约１．５ ｃａｎｏｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｅｒｏａｒｒａｙｓ（ＳＡＭ）分析软件和Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０软件（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＭＪ—ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ仪（美 基金项目：国家自然科学基金（３０７００８６５） ・１６８２・ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏ１．９，Ｎｏ．２２ Ｎｏｖ．２０ １ ０ 国ＢｉｏＲａｄ公司）。 １．３方法 １．３．４ ｍｉＲＮＡ表达的定量ＰＣＲ的验证随机挑选差 异表达的基因作为验证基因，以ｕ６为内参，设计、合成 参照ｍｉＲＮＡ 相应的ＰＣＲ引物，首先取１００ ｎｇ总ｍｉＲＮＡ加入２０ １．３．１ 芯片探针的设计及芯片的制备Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０设计成熟的ｍｉＲＮＡ序列，包括人３１３ 逆转录体系，１６ｑＣ ３０ ｍｉｎ，３７℃３０ ｍｉｎ，７０℃１０ ｍｉｎ，４￣Ｃ 条、大鼠１９２条和小鼠２６１条ｍｉＲＮＡ序列，由于人、大鼠 保存。再取Ｉ Ｉｘｌ ｃＤＮＡ加人２０ Ｉ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ体系， 和小鼠的ｍｉＲＮＡ三者具有共同的序列，取三者的并集共 扩增反应程序为：９５℃预变性１０ ｍｉｎ；９５￣Ｃ １５ Ｓ，６０℃３０ ７４￣Ｃ ３ Ｓ，测定荧光强度，重复４０个循环；７５℃至９５℃ 有３８７条，加上Ｎａｔｕｒｅ杂志预测的１２２个，最终在芯片上 Ｓ，一共设计了５０９条成熟ｍｉＲＮＡ序列对应的探针。考虑到 绘制溶解曲线；确定校准基因后再以同样的模板、优化 探针较短（ｍｉＲＮＡ长度在１９～２５ ｎｔ左右），可能影响探 后的实验体系、相同的扩增反应程序进行ｑＲＴ—ＰＣＲ扩 针在芯片表面的空问伸展，我们在探针上加上了与ｍｉＲ— 增；数据分析。 ＮＡ无关的序列使探针长度扩展到４０ ｎｔ，并在５ 端进行氨 ２ 结果 总ＲＮＡ的质量 分别抽提各只大鼠脑组织样品 基修饰。同时设计了ｔＲＮＡ和Ｕ６ ＲＮＡ的探针作为内源 ２．１阳性对照（内标），另外合成了与所有ＲＮＡ没有同源性的 的总ＲＮＡ，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０均在１．８～２．０之间，甲醛变 ８条ＲＮＡ作为外源阳性对照（外标），以不同的浓度掺人 性胶电泳见２８Ｓ和１８Ｓ条带清晰，未有明显降解条带， 到待检测的ＲＮＡ样品中。所有探针都在德国ＭＷＧ公司 说明抽提的ＲＮＡ纯度和浓度符合要求。ＲＮＡ芯片质量控制包括３种阳性对照和２种 合成，然后以４０ ｔｕｎｏｌ／Ｌ的浓度溶于ＤＮＡ点样液中。探 ２．２ ｍｉＲＮＡ芯片结果共得到２张芯片数据，伤后３ ｄ 的玻片上，每个探针重复３个点，点好的芯片通过探针上 ２．３ ｍｉＲＮＡ共 的氨基和芯片表面的醛基发生的希夫碱反应进行固定化 皮层与假手术对照组相比较发现差异表达的ｍｉ。 圣一针经Ｓｍａｒｔ Ａｒｒａｙ ＴＭ ４８芯片点样仪点制在经过醛基修饰 阴性对照，结果提示芯片质量符合要求。＿重＿量＿蒌－詈ｍ＿詈－量眦＿詈 ＿处理，然后室温保存备用。 １．３．２样品处理及芯片杂交有２５１个，其巾，表达上调的１４０个（其中２倍以上的２０ ：一． １个（其中２倍以上的５个）。具体 将各组６例样本分组混 个），表达下调的１１表１ ｍｉＲＮＡ芯片 表达增高２倍以上的ｍｉＲＮＡ列表 匀后，Ｔｒｉｚｏ｜一步法提取脑组织总ＲＮＡ，然后测定总 见表１和２。ＲＮＡ的Ａ２６０：Ａ２８０比值检测其纯度。然后用聚乙二 醇６０００（ＰＥＧ ６０００）分离出低分子质量ＲＮＡ（ＬＭＷ ＲＮＡ），分离后的ＲＮＡ片段用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ｍｉＲＮＡ名称 差异倍数 ６ ３ ３ ２ ３ ２ ２ ２ ２ ２ （ＰＡＧＥ）鉴定其分离效果。分离后的ＬＭＷ ＲＮＡ采用 Ｔ４ ＲＮＡ连接酶按照Ｔｈｏｍｓｏｎ等 的方法进行标记。 采用ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐＴＭ杂交盖片，将杂交盒置于可以促 进盖片下的杂交液流动的辅助杂交仪上，在４２￣Ｃ水浴 杂交过夜，然后在４２℃用洗液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）、 一一一一一一一一一一一一洗液Ⅱ（０．２×ＳＳＣ）分别洗４ ｍｉｎ，然后离心甩干芯片。 １．３．３ 图像获取和数据处理 采用ＬｕｘＳｃａｎＴＭ １０Ｋ— Ａ激光共聚焦芯片扫描仪扫描芯片，获得芯片的ＴＩＦＦ 图后，用ＳｐｏｔＤａｔａＴＭ软件提取数据。在芯片数据处理 时，先筛选除去弱信号点。由于一个探针点是由多个像 素的信号构成的，一个探针点中必须有超过３０％的像 素信号高于此探针本底背景信号值．４－２倍标准差，此探 针的信号才被视为有效信号，进入后续的数据分析。然 后用每张芯片上所有有效探针点信号的平均值进行归 一化，以便芯片之间的比较。为了确定各张芯片之间的 表２ ＩｎｉＲＮＡ芯片上表达下降２倍以上的ｍｉＲＮＡ列表 ｍｉＲＮＡ名称 差异倍数 ０．Ｏ４５３１７８ｌ６ ｍｉＲＮＡ表达差异的显著性，用ＳＡＭ分析软件中的ｔｗｏ ｃｌａｓｓ ｕｎｐａｉｒｅｄ进行芯片数据分析，差异基因筛选为： ＦＤＲ控制在５％以内，Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ为２．０倍。ｍｉＲＮＡ表 达的聚类分析采用每张芯片平均值归一化后的数据，用 Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０软件进行聚类分析 。 ０．Ｏ４３３Ｏ５２９０ Ｏ．０１５９３４４６４ ０．４９７ｌ８５ｌ６７ ０．４４８７３４６９５ 临床和实验医学杂志２０１０年１１月 第９卷 第２２期 ・１６８３・ ２．４定量ＰＣＲ验证据芯片结果随机选择ｍｉｒ一２１为 后３ ｄ出现大量ｍｉＲＮＡ的表达变化，但发生明显表达改 ＴＧＧＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＴ— 验证对象，设计引物（Ｆｏｒｗａｒｄ ５一ｑ３＂ＴＣＴＦＧＣＣＧＴＦＣＴＧ． 变（按２倍差异标准）的数量并不多，表达上调２倍以上 ＴＡＡＧＴＧ一３．Ｒｅｖｅｒｓｅ ５ 的２０个，表达下调２倍以上的５个。 下一步工作将在脑创伤动物模型上逐个研究差异 ＧＡＡ一３），内参Ｕ６的引物（Ｆｏｒｗａｒｄ ５一ＣＴＣＧＣＴＹＣＧ． ＧＣＡＧＣＡＣＡ 一３．Ｒｅｖｅｒｓｅ ５一ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＩＴ— 表达的ｍｉＲＮＡ正负向干预对脑创伤结果的影响，以检 ＧＣＧＴ一３）。ｍｉＲＮＡ芯片上Ｒａｔｉｏ值是２．８３７２，定量 验颅脑创伤治疗中的ｍｉＲＮＡ干预策略的可行性。 ＰＣＲ Ｒａｔｉｏ值是３．２１３１，可见Ｒａｔｉｏ值趋势基本吻合，说 明芯片结果可信。 参考文献 ［１］Ｂｕｓｈａｔｉ Ｎ，Ｃｏｈｅｎ ＳＭ．ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ ３讨论 颅脑创伤过程中的基因表达变化犹如一个“黑匣 子”，并不是单一的信号通路的改变，而是呈现错综复杂 的立体网络变化，颅脑创伤瞬间迅速激发了多个基因的 表达改变，上游基因表达改变又导致了下游相关基因的 表达改变，出现级联瀑布反应和扩大效应。本研究室曾 利用基因芯片研究临床脑创伤后手术患者的创伤灶附 近皮层脑组织基因表达变化情况，筛选出了部分与脑创 伤密切相关的基因，相关研究结果已经公开发表 ，并 将在后期研究中逐步验证其干预效果。可以预见的是， 在如此复杂庞大的基因表达网络中，单独对某个基因实 施干预，对脑创伤的治疗影响将是有限的，如果能够同 时对多基因表达进行干预，将会大大提高效率。现代生 命科学的研究进展已为我们带来了事半功倍的曙光，这 丝曙光要得益于ＲＮＡ的研究进展——ｍｉＲＮＡ的发现。 ｍｉＲＮＡ是近年发现的一种由２１～２３个碱基组成的 内源性非编码单链小分子ＲＮＡ，广泛存在于真核生物 中。哺乳动物的ｍｉＲＮＡ与靶标ｍＲＮＡ不是序列严格互 补的完全结合，故而每个哺乳动物的ｍｉＲＮＡ都能阻止 很多个下游靶标ｍＲＮＡ的翻译，从而封闭多个基因的表 达。所以从干预单个的基因转向干预ｍｉＲＮＡ可能会让 我们的基因治疗策略事半功倍。但迄今为止，国内外有 关ｍｉＲＮＡ的研究都集中在生物生长发育、分化，肿瘤， 心脏病，艾滋病等慢性生理或病理过程中，鲜有见到 ｍｉＲＮＡ在急性损伤病理状态时的研究报道 。。 。 本研究目的是探索脑创伤后皮层组织ｍｉＲＮＡ的表 达变化情况，寻找与创伤后果密切相关的ｍｉＲＮＡ。因为 在脑创伤研究领域鲜见ｍｉＲＮＡ的研究报道，对脑创伤 后ｍｉＲＮＡ的表达情况尚不清楚，所以本研究应用了高 效的基因表达研究武器——ｍｉＲＮＡ芯片初步筛选和鉴 定脑创伤后明显表达改变的ｍｉＲＮＡ。结果发现脑创伤 Ｂｉｏｌ，２００７，２３：１７５—２０５． ［２］Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ Ｍ，Ｐａｒｋｅｒ Ｊ，Ｐｅｒｏｕ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｕｓｔｏｍ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，１ （１）：４７—５３． ［３］Ｅｉｓｅｎ ＭＢ，Ｓｐｅｌｌｍａｎ ＰＴ，Ｂｒｏｗｎ ＰＯ，ｃｔ ａ１．Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ—ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９８，９５（２５）：１４８６３—１４８６８． ［４］ 雷平，张建宁，杨新宇，等．基因芯片筛选人脑创伤皮层差异表达 基因的实验研究［Ｊ］．中华神经外科杂志，２００７，２３（７）：４９０－４９２． ［５］Ｇｉｒａｌｄｅｚ ＡＪ，Ｍｉｓｈｉｍａ Ｙ，Ｒｉｈｅｌ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ＭｉＲ一４３０ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｅａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｍａｔｅｒｎａｌ ｍＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６， ３１２（５７７０）：６５—６６． ［６］Ｐｅｋａｒｓｋｙ Ｙ，Ｓａｎｔａｎａｍ Ｕ，Ｃｉｍｍｉｎｏ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｃｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎ— ｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｉＲ一２９ ａｎｄ ｍｉＲ一１８１［Ｊ］． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，６６（２４）：ｌ１５９０～１１５９３． ［７］ Ｅ１ Ｏｕａａｍａｒｉ Ａ，Ｂａｒｅｕｋｈ Ｎ，Ｍａｒｔｅｎｓ ＧＡ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ一３７５ ｔａｒｇｅｔｓ ＰＤＫ１ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ—ｅｅＨｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００８，５７（１０）：２７０８—２７１７． ［８］ Ｋａｊｉｍｏｔｏ Ｋ，Ｎａｒａｂａ Ｈ，１ｗａｉ Ｎ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｄ ３Ｔ３一Ｌ１ ｐｒｅ—ａｄｉｐｏ－ ｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＲＮＡ，２００６，１２（９）：１６２６—１６３２． ［９］Ｈｏｎａｓｔｅｉｎ Ｅ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ＪＨ，Ｙｅｋｔａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ一１９６ ａｃｔｓ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｈｏｘｂ８ ａｎｄ Ｓｈｈ ｉｎ ｌｉｍｂ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００５，４３８（７０６８）：６７１—６７４． ［１０］Ｇａｂｒｉｅｌｙ Ｇ，Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ Ｔ，Ｋｅｓａｒｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ２１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｌｉｏ— ｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｇｅｔｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００８，２８（１７）：５３６９—５３８０． ［１１］Ｚｈｕ Ｓ，Ｗｕ Ｈ，Ｗｕ Ｆ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ一２１ ｔｒａｇｅｔｓ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２００８，１８（３）：３５０— ３５９． ［１２］Ｓａｙｅｄ Ｄ，Ｒａｎｅ Ｓ，Ｌｙｐｏｗｙ Ｊ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ一２１ ｔａｒｇｅｔｓ Ｓｐｒｅｕｔｙ２ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌｒａ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈｓ［川．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，２００８，１９（８）： ３２７２—３２８２． （收稿日期：２０１０—０８—２６）
