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植物细胞质雄性不育恢复基因分子生物学研究进展

来源：年旅网

第22卷　第2期　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　

2007年　4月　　　　　　　　　　JournalofYunnanAgriculturalUniversity　　　　　

Vol122　No12

Apr.2007

植物细胞质雄性不育恢复基因

分子生物学研究进展

邓明华,文锦芬,朱海山,邹学校,张　宏

(1.云南农业大学园林园艺学院,云南昆明650201;2.昆明理工大学现代农业工程学院,云南昆明650224;

3.湖南省农业科学院,国家辣椒新品种技术研究推广中心,湖南长沙410125)

摘要:综述了近10年来植物细胞质雄性不育恢复基因分子生物学的研究进展。包括:(1)恢复基因的遗传;(2)恢复基因的定位;(3)恢复基因的克隆;(4)恢复基因的结构特征;(5)育性恢复的分子机理等。关键词:细胞质雄性不育;恢复基因;克隆;分子机理中图分类号:Q943　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2007)02-0172-05

AdvancedMolecularBiologicalResearchontheFertilityRestorationGeneforCytoplasmicMaleSterilityinPlant

DENGMing2hua,WENJin2fen,ZHUHai2shan,ZOUXue2xiao,ZHANGHong

(1.FacultyofHorticultureandLandscape,YAU,Kunming650201,China;2.FacultyofModernAgriculturalEngineering,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650224,China;3.NationalResearchandExtensionCenterof

NewPepperVarietyTechnology,HunanAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410125,China)

Abstract:Itwasreviewedherethatthemajoradvancesofbiologicalresearchonthefertilityrestorationgeneforcytoplasmicmalesterilityinplantinthepastdecade.Itfocusedonthegeneticandlocalizationandcloneofrestorationgene,theirmolecularcharacteristicsandtheirpossiblemechanismoffertilityrestoration.

Keywords:cytoplasmicmalesterility;restorationgene;cloning;molecularmechanism

　　植物细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterili2

ty,CMS)是一种因为线粒体基因区域发生突变、重排和转座等改变,导致不能产生有活力花粉的母性遗传现象,是高等植物中比较常见的生物学特征。目前已经至少在150多个物种中发现了细胞质雄

[1]

性不育现象。利用雄性不育系作母本制种可以省去人工去雄和人工授粉,实现杂交种子大规模生产。因此其恢复基因的研究一直受到高度重视,经过科学家们的努力,到目前为止已经在水稻等多种

[2～7]

作物恢复基因的研究中取得明显进展,已经克

[8][9][10,11][13～15]

隆了玉米、矮牵牛、萝卜以及水稻

的恢复基因,这为从分子水平揭示育性恢复的分子

机理创造了有利条件。1　恢复基因的遗传

恢复基因的遗传研究是恢复系选育的理论基础,其遗传学的研究一直是研究的重点内容,恢复基因的经典遗传学研究大多集中在恢复性的基因对数、基因互作等方面。普通方法是通过花粉育性、结实率等的调查来推测控制育性的恢复基因的遗传。但由于育性分离世代往往表现为既有可分组趋势,又存在组界模糊的“质量—数量”特性,以

　收稿日期:2006-04-17　

3基金项目:云南省自然科学青年基金(2005C0051Q);云南省教育厅青年科学研究基金(04Y559B);湖南省蔬菜工程

与技术重点实验室资助项目。

第2期　　　　　　邓明华,等:植物细胞质雄性不育恢复基因分子生物学研究进展及受环境和人为主观因数的影响,造成对恢复性的研究常常因为育性指标和材料的不同而结果不尽相同。大多数研究表明:少数显性效应主基因控制细胞质雄性不育的恢复性。玉米T型CMS恢复性

[8][16][1]

与2对基因有关,而玉米S型、矮牵牛的

[17]

CMS不育恢复性受1对基因控制,向日葵的CMS恢复性至少受到2对恢复基因的控制。2　恢复基因的定位

173

源性比较表明Rf2编码乙醛脱氢酶基因,并且具有

线粒体靶向信号。3.2　萝卜Ogu型CMSRf0基因的克隆利用集群分离分析方法找到了Rf0附近的RFLP标记,通过探针鉴定出拟南芥与萝卜染色体共线性的区域,然后以拟南芥序列为探针,找到与Rf0更加紧密连锁的分子标记,在对与rf0完全连锁的BAC和cosmid克隆测序的基础上,又对所得到的序列进行转基因试验,发现其中Bgl-5的转基因当代和后代育性能恢复,再结合cD2NA末端快速测序(RACE)鉴定出了Rf0的结构。该基因编码一个687个氨基酸的蛋白质,并含有线粒体定位前导序列和16个PPR基元序列。

[13]

DESLOIRE等利用同样的方法也克隆了萝卜Ogu型CMS的恢复基因Rf0。测序结果表明:Rf0基因是PPR基因家族中的一个成员。3.3　萝卜Kos型CMSRfk1基因的克隆

BROWN等

[10]

植物细胞质雄性不育恢复基因的定位是近年

来研究的一大热点,分子标记技术定位是当今恢复基因定位的主要方法,迄今为止许多植物细胞质雄性不育恢复基因已经进行了分子标记定位。水稻CMS-BT育性恢复受单个核恢复基因Rf-1控制,CMS-WA育性恢复主要受2对显性基因Rf-3和Rf-4控制,且分别位于第1,10染色体上,Rf-1和Rf-4可能等位,CMS-HL育性恢复由第10染色体上的单个位点控制,并且与Rf-1和Rf-4非常靠近。后来又发现了CMS-HL的恢复基

因Rf-5和Rf-6,它们对应于CMS-HL的Rf位点,但位于第10染色体不同区域,与Rf-1和Rf-[1,18～20]

4不等位。可见水稻第10染色体长臂是不同类型CMS恢复基因的密集区。黑麦P型和G型CMS恢复基因与小麦T型和K型CMS恢复基因

[21,22]

位于同一区域1BS染色体上。油菜Nap型和

[23]

Pol型CMS恢复基因定位到一个基因座,说明恢复基因座可能是复合的,且可能不同CMS恢复基因族聚在一个区域。3　恢复基因的克隆

在定位了萝卜Rfk1基因的基础上,

构建了含有Rfk1基因临界范围的λ和柯斯载体的毗连群,并将每个载体导入CMS油菜之后来筛选育性恢复株。结果发现了一个能使CMS植株育性恢复的片段。通过测序,克隆到了萝卜Kos型CMSRfk1基因—orf685。并发现orf685含多个重复的PPR基元序列,编码一个687个氨基酸的蛋白质。3.4　矮牵牛CMSRf基因的克隆

MIAI等

[11]

植物CMS育性恢复机理的最终阐明,有赖于

恢复基因的分离和克隆,到目前为止,已经克隆了

[8～15]

玉米、水稻、矮牵牛和萝卜的恢复基因。3.1　玉米T型CMSRf-2基因的克隆采用转座子标签法获得由Mu转座子插入rf2的突变体,随后以Mu转座子为探针对侧交后代进行DNA杂交分析,结果所有雄性不育株均带有一个314kb的片段,而所有可育姊妹株

CUI等

[8]

在精细定位群体中找到与Rf

基因紧密连锁的一个AFLP标记,并利用该标记从矮牵牛恢复系基因组BIBAC文库中找到与Rf共分离的SB5克隆,对SB5测序和预测候选Rf基因的ORF,再对转运肽和蛋白质利用相关软件进行分析,找到具有线粒体靶向信号和具有PPR基序的两个相邻的ORF,并用两个ORF侧序的PCR引物扩增恢复系的相应序列,将能得到PCR产物的含有ORF的DNA片段导入不育系,发现其育性恢复,表型与转基因共分离,说明该ORF能使育性恢复。3.5　水稻CMS恢复基因的克隆

BENTOLILA等

[9]

中均不含该片段,说明该DNA片段与rf2紧密连锁

或者就是rf2位点的一部分,进而从cDNA文库中利用Mu转座子为探针,分离到rf2cDNA克隆,并利用该cDNA克隆在恢复系雄花花穗总RNA中分离到转录本,而获得全长Rf2基因。序列分析和同

首先把Rf-1基因定位到两个

RFLP标记之间0.1cM的范围内,以其中一个标记为起点,对Rf-1位点作进一步精细定位,构建覆盖Rf-1候选基因的λ噬菌体重叠群克隆,并使重叠群中至少有一个克隆带有Rf-1基因的全长。通过一系列的试验,发现了带有Rf-1基因组片段ctG16,并进行转基因验证,发现转ctG16基因的转

KOMORI等

[14]

174云南农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　第22卷

响其表达

[14]

基因植株对CMS-BT水稻具有恢复性。然后通过

探针筛选cDNA文库,分离到相应克隆,从而找到Rf-1基因的编码区。4　恢复基因的结构特征4.1　恢复基因PPR保守基序

。KAZAMA等

[28]

把Rf-1基因转入

不育系,在转基因愈伤组织中检测到Rf-1专一性作用产生的B-atp6转录本,而在对照不育系中却没有。HERNOULD等

[29]

将编辑过的和未编辑过

的小麦atp9编码序列融合到酵母线粒体基因cox4转导肽编码序列,并转入烟草细胞核基因组,表达的蛋白被运输到线粒体,发现含编辑过atp9的转基因为可育的,而含有未编辑过atp9的转基因植株都是不育或者是半不育的。

恢复基因的另外一种作用方式可能是编码一种蛋白质酶,以翻译后水平作用机制。通过减少不育基因编码的蛋白质积累量而引起育性的恢复[30]

对已经克隆的恢复基因进行生物信息学分析,发现除玉米Rf2外,其编码的蛋白质均含有由35

[9,12,14,15]

个氨基酸形成的PPR基序的重复结构。恢复基因都含有线粒体转导序列,并证明其表达产物都是以线粒体为作用目标的。序列同源性比对表明:恢复基因PPR保守基序与已经报道的PPR基序有高度的一致性。PPR是一个大的基因家族,拟南芥基因组中含有约200个PPR和相关的TPR基因,其编码的蛋白质有2/3是以细胞器为作用目标。含PPR基序的蛋白质利用其大沟足以结合RNA链,因而可能在细胞器内具有RNA代谢功能。在多个物种的恢复基因中存在PPR保守基序,这意味着可以在其它物种中扫描恢复基因附近的PPR特征作为鉴定Rf候选基因的有效手段。4.2　恢复基因的线粒体转导序列

恢复基因另外一个重要的特征是都含有线粒体转导序列。玉米T型CMS的Rf2基因可能编码类似乙醛脱氢酶的蛋白质,能改善线粒体因为URF13表达所产生的损伤。对水稻BT型CMSRf1的相关生物信息学分析表明:其Rf1基因编码以线粒体为目标的蛋白质。对矮牵牛CMS恢复基因,Kos萝卜CMS恢复基因进行分子生物学分析,也

[1]

[14]

。CUI等[8]

研究表明:玉米T型CMS细胞质

线粒体URF13会引发细胞质雄性不育,而两个核恢复基因Rf1和Rf2的同时存在能使育性恢复。同时还发现两个核恢复基因之一的Rf1可以使URF13所产生的毒蛋白的积累量减少约80%。在

油菜Ogu型CMS中,恢复基因Rf0能减少育性恢复植株花蕾中的ORF138蛋白,在花药发育期尤其显著。花蕾和花药核糖体分析结果表明,不育植株和可育植株ORF138转录物翻译效率相同,因此推测Rf0基因产物在翻译后水平使ORF138蛋白的稳定性下降,从而导致蛋白积累减少而恢复育性

[31,32]

。

6　展望

利用雄性不育系做母本生产杂交一代种子是节约制种成本和提高杂种纯度的有效办法,这在很多作物上已经大规模应用,但大多数作物的细胞质雄性不育恢复系选育困难。利用与恢复基因紧密连锁的分子标记,不仅有利于直接、方便、快速地利用分子标记辅助选育恢复材料,而且也将促进恢复基因的高效转育

[5]

证明含有线粒体转导序列,并证明其表达产物都是

以线粒体为作用目标的。实际上在一些CMS的线粒体内已经发现其转录产物被恢复基因所改[1,8,15]变。5　育性恢复的分子机理

,培育出多样性的恢复系以满

恢复基因通过改变CMS相关嵌合基因的表达

[23～26]

而抑制雄性不育的性状。恢复基因对不育相关区域的作用方式至少有转录后水平和翻译后水平两种方式。

恢复基因的一种作用方式可能是编码一种RNA加工酶,通过在转录水平影响不育相关区域转录本的加工、编辑,进而导致蛋白谱的差异,引起

[27]

育性恢复。近期研究发现:水稻Rf-1编码PPR蛋白通过对线粒体CMS相关RNA编辑而影

足杂交种生产的要求。

近年来研究发现:恢复基因产物中PPR基序非常保守,相关物种同源基因在染色体上排列的共线性现象存在于单子叶以及双子叶植物不同物种间,以及多个物种细胞质雄性不育恢复基因的精细定位,将会加快不同物种恢复基因的克隆进程。同时恢复基因的克隆不仅为培育转基因新型恢复系提供了机遇,也将为阐明植物核—质互作模型的分子机制做好铺垫。

第2期　　　　　　邓明华,等:植物细胞质雄性不育恢复基因分子生物学研究进展

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