辽东本草牌参灵片增强免疫力功能实验研究

曾祥云;仇仁春;曹志强 【期刊名称】《人参研究》 【年(卷),期】2017(000)003 【总页数】5页(P14-18) 【作 者】曾祥云;仇仁春;曹志强

【作者单位】辽宁祥云药业,桓仁117200;辽宁祥云药业,桓仁117200;吉林人参研究院,通化134001 【正文语种】中 文

依据卫生部2003年版《保健食品检验与评价技术规范》，辽宁祥云药业研制的“辽东本草牌参灵片”在辽宁省疾病预防控制中心进行了增强免疫力功能实验。结果表明：送检样品对实验动物体重、体重增重、胸腺重/体重比值、脾重/体重比值无明显影响。0.25 g/kgBW实验组能促进二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应形成，0.50 g/kgBW实验组能提高小鼠脾淋巴细胞增殖能力，各实验组均未能提高小鼠的抗体生成细胞数量及血清的抗体积数，各实验组均未能增强小鼠碳廓清能力，0.50 g/kgBW实验组能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，各实验组均能增强小鼠NK细胞活性。 1.1 样品

辽东本草牌参灵片由辽宁祥云药业有限公司提供，原料为棕色颗粒。企业推荐日摄入量为1.5 g/ 60kgBW。以原料作为受试物，蒸馏水做溶剂。 1.2 实验动物

选用辽宁长生生物有限公司繁殖的SPF级18～22g雄性昆明种小鼠200只（其中抗体生成细胞检测和小鼠血清溶血素测定共用一组实验动物、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠NK细胞活性测定共用一组实验动物、其余各项试验均使用一组实验动物），实验动物生产许可证号为SCXK（辽）2010-0001。无菌块状鼠料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号为SCXK(京）2009-0008。

屏障系统动物实验室，恒温恒湿，温度22±1.5℃，湿度50%±10%，工作照度200～280 lx,人工照明12 h黑夜12 h，噪音＜60 dB，实验动物使用许可证号为SYXK(辽）2011-0005。 1.3 计量选择与受试物给予方式

按企业推荐人体日摄入量的30倍、20倍、10倍设计，试验设0.75、0.50、0.25 g/kgBW 3个剂量组和样品溶剂对照组。分别称取受试物3.75、2.50、1.25 g，加入蒸馏水调至100 mL,样品配制浓度分别为0.038、0.025、0.013 g/mL，使用时新鲜配制。灌胃方式给予样品，按体重调整灌胃容量（灌胃容量按20 mL/kgBW计算），每天灌胃1次。连续30 d，末次给样品30 min后分别测定各项免疫指标。 1.4 主要仪器与试剂

电子分析天平（感量0.0001 g）、电子天平（感量0.01 g）、酶标仪、二氧化碳培养箱、分光光度计、生物显微镜、离心机、恒温水浴箱。

二硝基氟苯、丙酮、麻油、RPMI 10细胞培养液，小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、HanK’s液（pH7.2～7.4)、PBS缓冲液（pH7.2～7.4)、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、琼脂糖、印度墨汁、Na2CO3、SRBC、鸡红细胞、YAC-1细胞、RPMI 10完全培养液、乳酸锂、硝基氯化四氮唑（INT)、吩嗪二甲脂硫酸盐（PMS)、NAD、

0.2 mol/L的Tris-HCI缓冲液（pH8.2)、2.5%Triton X 100。 1.5 试验方法

1.5.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）：

1.5.1.1 脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用200目滤网将脾磨碎，制成单个细胞悬液。用Hank’s液洗2次，每次离心10 min（1 000 r/min）。最后将细胞悬液浮于完全培养液中，计数活细胞（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。

1.5.1.2 淋巴细胞增殖反应与测定：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液（相当于7.5 μg/mL)，另一孔作为对照，置5%CO2、37℃CO2培养箱中培养72 h。培养结束前4 h,每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7不含小牛血清的RPMI 10培养液，同时加入MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。用分光光度计，以570 nm波长测定光密度值。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，即可判定该项实验结果阳性。 1.5.2 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法）：

1.5.2.1 致敏：每鼠腹部皮肤用婴儿理发器脱毛，范围约3 cm×3 cm，用DNFB溶液50 μL均匀涂抹致敏。

1.5.2.2 DTH的产生与测定：5 d后，用DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24 h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片，称重，用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试物组的差值显著高于对照组的差值，即可判定该项实验结果阳性。 1.5.3 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）：

1.5.3.1 制备补体：采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1

mL压积SRBC加入到5 mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30 min。经常震荡，离心取上清，分装，-70℃保存。用时以SA液按1:8稀释。

1.5.3.2 玻片涂膜：在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5 g琼脂糖加双蒸水至100 mL，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。

1.5.3.3 免疫动物：取新鲜绵羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心。（2 000 r/min)10 min,将压积SRBC用生理盐水配成2%（v/v)细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2 mL.

1.5.3.4 脾细胞悬液制备：将SRBC免疫5 d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，用200目滤网将脾磨碎，制成细胞悬液，离心（1 000 r/min）10 min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在RPMI 10培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。

1.5.3.5 空斑的测定：将表层培养基（1 g琼脂糖加双蒸水至100 mL)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加50 μL 10%SRBC（v/v，用SA液配制），20 μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5 h，然后将用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入到玻片架凹槽内，继续孵育1.5 h后，计数溶血空斑数。受试物组的空斑数/106脾细胞数显著高于对照组，即可判定该项实验结果阳性。 1.5.4 血清溶血素的测定（血凝法）：

凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100 μL，再加入100 μL0.5%（v/v）的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度。血球凝集程度一般分为5级（0-IV)记录，按下式计算抗体积数，受试物组的抗体积数显著高于对照组的抗体积数，即可判定该项实验结果阳性。

抗体积数=(S1+2S2+3S3........nSn)

式中1、2、3........n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。 Ⅰ级红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞。 Ⅱ级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。 Ⅲ级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。 Ⅳ级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。 1.5.5 小鼠碳廓清试验：

1.5.5.1 注射墨汁：称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10 g体重0.1 mL计算。待墨汁注入，立即计时。

1.5.5.2 测定：注入墨汁后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL,并立即将其加到2 mL Na2CO3溶液中。以600 nm波长测定光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试物组的吞噬指数明显高于对照组的吞噬指数，即可判定该项实验结果阳性。 1.5.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法）：

1.5.6.1 鸡红细胞悬液制备：取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶内，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤3次，离心（2 000 r/min，10 min)，去上清，用生理盐水配成20%（v/v）的鸡红细胞悬液。

1.5.6.2 吞噬功能测定：每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL。间隔30 min,颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定与鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min。然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30 min。孵毕，于生理盐水中漂

洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1：1丙酮甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。受试物组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较，差异有显著性，即可判定该项实验结果阳性。按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。 1.6 试验数据统计

在毒理检验数据录入统计报告一体化自动分析程序中，各种统计学检验方法同时自动进行统计分析，并将分析得到的相关数据自动传输至检验报告表格的指定位置中。对计量资料，做多样本方差齐性检验（Bartlett法）和各实验组与溶剂对照组的双样本方差齐性检验。方差齐，多样本比较采用单因素方差分析，各实验组与溶剂对照组比较用最小显著差法、Dunnett法、新复极差法；方差不齐，采用近似F检验和双样本异方差t检验或进行变量转换（百分率资料用反正弦函数转换后进行F检验）或采用秩和检验（Wilcoxcn两样本比较法）。计数资料采用行×列表x2检验，各实验组与溶剂对照组比较采用四格表x2检验，对不符合x2检验条件的资料采用秩和检验（Wilcoxcn两样本比较法）。 1.7 结果判定

增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性

测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。 2.1 脏器/体重比值测定结果：由表1可见，各实验组胸腺/体重比值及脾脏/体重比值与样品溶剂对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）。

在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为4级：

Ⅰ级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或淡黄带绿色，胞核浅紫色。 Ⅱ级：轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色。 Ⅲ级：重度消化。胞质淡染，胞核淡浅灰色。

Ⅳ级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。

1.5.7 NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶法）：

1.5.7.1 靶细胞的传代（YAC-1细胞）：实验前24 h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI 10完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。

1.5.7.2 脾细胞悬液的制备（效应细胞）：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用200目滤网将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank’s液洗2次，每次离心10 min（1 000 r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水20 s，裂解红细胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1 000 rpm, 10 min离心，用1 mL含10%小牛血清的RPMI 10完全培养液重悬，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI 10完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。

1.5.7.3 NK细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各100 μL（效靶比50：1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各100 μL；上述各项均设3个平行孔，于

5%CO2、37℃CO2培养箱中培养4 h,然后将96孔培养板以1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，反应3 min，每孔加入1 mol/L的HC130 μL，在酶标仪490 nm处测定光密度值（OD）。受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。按下式计算NK细胞活性。

2.2 DNFB诱导小鼠DTH试验结果：由表2可见，各实验组初始体重、试验末体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异(P＞0.05);由表3可见，0.25 g/ kgBW实验组的左右耳重量差值均显著高于样品溶剂对照组（P＜0.05）。 2.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验和小鼠NK细胞活性测定结果：由表4可见，各实验组初始体重、试验末体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；由表5可见，ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，0.50 g/kgBW实验组的光密度差值显著高于样品溶剂对照组（P＜0.05）;各实验组的小鼠NK细胞活性均显著高于样品溶剂对照组（P＜0.05）。

2.4 小鼠抗体生成细胞检测和小鼠血清溶血素测定结果：由表6可见，各实验组初始体重、试验末体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞ 0.05）；由表7可见，各实验组的溶血空斑数及抗体积数与样品溶剂对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）。

2.5 小鼠碳廓清试验结果：由表8可见，各实验组初始体重、试验末体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05)；由表9可见，各实验组的吞噬指数a与样品溶剂对照组比较均无显著性差异（P＞0.05)。

2.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果：由表10可见，各实验组初始体重、试验末体重，体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；由表11可见，0.50 g/kgBW实验组的吞噬百分率、吞噬指数与显著高于样品溶剂对照组（P＜0.05）。

试验结果表明：

3.1 各项试验的实验动物体重和体重增重无明显改变。 3.2 胸腺/体重、脾脏/体重的比值无明显改变。

3.3 细胞免疫功能：0.50 g/kgBW实验组能提高小鼠脾淋巴细胞增殖能力； 0.25 g/kgBW实验组能促进二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应形成能力。 3.4 体液免疫功能：各实验组均未能提高小鼠的抗体生成细胞数及小鼠血清的抗体积数。

3.5 单核-巨噬细胞功能：各实验组均未能增强小鼠碳廓清能力；0.50 g/kgBW实验组能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。

3.6 NK细胞活性测定：各实验组均能提高小鼠NK细胞活性。