化合物对Con A诱导小鼠脾细胞增殖的影响

Con A诱导小鼠脾细胞增殖的影响

(方

)

待测样品配制：EP管需消毒 称量时尽量无菌操作，之后操作完全无菌操作。

化合物一级贮存液配制：称取化合物 20mg 左右+ DMSO 0.2ml 左右= 100mg/ml （0.2 ml） 取一干净已消毒EP管，放入天平中，去皮，用小药匙盛15至20mg的样品或用加样器吸取20μl的样品于EP管中，记录样品重量，按10mg样品加100μl DMDO的比例，加DMSO150至200μl，此为100mg/ml的一级贮存液。

化合物二级贮存液配制：取化合物一级贮存液 10μl +全培1000μl = 1mg/ml （1ml）

化合物应用液配制：取化合物二级贮存液 30μl +全培270μl = 100μg/ml （1ml） 96孔板每孔加50μl, 终浓度25μg/ml。另加Con A (8μg/ml) 50μl, 细胞悬液100μl。每组5个复孔。

对照溶媒应用液配制：10μl DMSO+ 全培1ml。之后取60μl +0μl全培即可。

溶媒对照组：96孔板每孔加对照溶媒应用液50μl, 另加全培50μl，细胞悬液100μl。每组5个复孔。

Con A组：每孔加对照溶媒应用液50μl, 另加Con A (8μg/ml) 50μl, 细胞悬液100μl。每组5个复孔。

Con A配制：（写一个稀释方案）

原包装：产品号: L77-25 MG 产品批号: 019K7670 Sigma公司. 购买日期：20091109

Concanavalin A, From Concavalia ensiformis(Jack Bean), Type Ⅶ.

应用液：8μg/ml, 每孔50μl, 终浓度2μg/ml.

小鼠脾细胞准备

取小鼠1只，拉颈椎处死，无菌取出脾脏放入盛有3ml左右全培的培养皿中，用两块载玻片挟持捻碎，移入离心管中，用吸管吹打数遍，200目尼龙布过滤，滤液经1800转离心3分钟，吸弃上清，收集细胞，用3ml全培悬浮，计数（计数液：3%冰醋酸），然后用全培配成4×106个细胞／ml，在已加好待试药物和对照试剂的96孔板中每孔加入上述细胞悬液100µ1（用磁棒边搅拌边加入），使总体积为200µ1，置培养箱中在饱和湿度、5％C02、37℃条件下，培养48小时。

最后在检测孔周围的孔中加上200µ1蒸馏水，防止蒸发。

细胞计数：在0.78ml计数液中加入20µ1细胞悬液。

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细胞浓度=计数板四周细胞数总和÷4×40×10000=计数板四周细胞数总和×10个/ml

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本实验需细胞总数为1.4×10，为了留有冗余，按2×10计算。用2×10除以所计数的细胞浓度，即为所需要的细胞ml数，用全培加至5ml即可。

完全RPMI10培养液(全培)=含10％新生牛血清及青、链霉素的RPMll0培养液

细胞增殖程度测定

小鼠脾细胞培养结束前4小时，每孔加入0.25％MTT(生理盐水配制)20µ1，继续培养4小时，然后吸弃上清，每孔加DMSO100µ1，振摇2分钟使MT'T的紫色还原产物完全溶解。最后用酶标仪在570nm处测定光密度，结果用570nm处的光密度值(OD570)表示。

结果意义：待试药物如果抑制Con A诱导的脾细胞的生长，说明化合物对T细胞的增殖反应有抑制作用。提示有免疫抑制作用。

96孔板样品分布：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H

W W W W W W W P A W C M A Z P A W C M A Z P A W C M A Z W W C C M M W W W W W W A A Z Z P P A A W W W W W W W W C：溶媒对照组

M: 化合物M组 A：Con A对照组 Z：化合物Z组 P：化合物P组 W：蒸馏水