一种DNA聚合酶错配率的检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 1044221 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.09.09

(21)申请号 201510271941.3(22)申请日 2015.05.25

(71)申请人北京全式金生物技术有限公司

地址100000 北京市海淀区西小口路66号

中关村东升科技园B-3号楼四层(72)发明人耿亮 贺翠婷 辛文 马静(74)专利代理机构北京正理专利代理有限公司

11257

代理人张文祎(51)Int.Cl.

C12Q 1/48(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页序列表5页 附图2页

()发明名称

一种DNA聚合酶错配率的检测方法(57)摘要

本发明公开一种DNA聚合酶错配率的检测方法，包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化上述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。本发明提供的方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。

C N 1 0 4 8 9 4 2 2 1 A CN 1044221 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种DNA聚合酶错配率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；

2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；

4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述质粒不表达抗ccdB蛋白毒性的基因。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中酶切时内切酶识别的位点为步骤1)引入的酶切位点。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LacZα基因的DNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4)所述LacZα基因连接到所述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述宿主菌为对ccdB蛋白无抗性的大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述宿主菌为DH5α、Top10或Trans1-T1。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述培养基为固体培养基。9.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于：所述培养基含有X-gal和IPTG。10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述错配率的计算方法为：

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说 明 书

一种DNA聚合酶错配率的检测方法

1/8页

技术领域

[0001]

本发明涉及一种生物学检测方法。更具体地，涉及一种酶学检测方法。

背景技术

DNA聚合酶保真性检测的经典方法，是利用蓝白斑显色的方法，以蓝白斑比例的形式反映DNA聚合酶扩增LacZα基因时的突变率，来衡量DNA聚合酶保真性。最传统的方法是利用λ噬菌体携带扩增的LacZα基因，感染细胞后进行蓝白斑显色，例如Kelly S.Lundberg等(High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus,1991,Gene)、Janice Cline等(PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases,1996,Nucleic Acids Research)。该方法操作繁琐，且有造成实验室发生噬菌体污染的风险。也有学者开发出基于质粒而非噬菌体的检测方法，如Stanislaw K等(Plasmid-based LacZαassay for DNA polymerase fidelity:application to archaeal family-B DNA polymerase,2009,Nucleic Acids Research)、Brian J.Keith等(A plasmid-based lacZαgene assay for DNA polymerase fidelity measurement,2013,Analytical Biochemistry)。但这些方法都要用到切刻内切酶，制备含有单链区域的质粒(即“Gapped DNA”)，实验步骤较为繁琐。另有学者扩增含有部分抗性基因片段的LacZα基因，然后利用载体与片段间抗性基因的功能性互补消除背景干扰，如Wayne M.Barne等(The fidefity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion,1992,Gene)。但该方法扩增插入片段时，可能在抗性基因片段上出现突变，使得重组质粒无法正常生长，导致克隆数减少，低估DNA聚合酶的错配率。[0003] 因此，需要提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。

[0002]

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：[0006] 一种DNA聚合酶错配率的检测方法，该方法包括如下步骤：[0007] 1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；[0008] 2)内切酶酶切，获得线性化质粒；[0009] 3)扩增LacZα基因；

[0010] 4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；

[0004]

5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；[0012] 6)计算错配率。

[0013] 本发明所述同义突变是指：通过突变获得与野生型ccdB基因(见序列表SEQ ID

[0011]

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说 明 书

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No.2)DNA序列不同的突变型ccdB的DNA序列，但是突变型ccdB基因编码的ccdB蛋白序列与野生型ccdB基因编码的蛋白序列相同。同义突变的目的是为了在野生型ccdB基因的DNA序列内引入内切酶的酶切位点，即突变型ccdB基因具有内切酶酶切位点。突变型ccdB基因通过同义突变获得的酶切位点应该在步骤1)所述的质粒上是唯一的。优选地，酶切位点位于突变型ccdB基因序列中间靠近5’端部分。优选地，酶切位点为高效内切酶识别的位点。

[0014] 本发明方法的原理是：ccdB基因是致死基因，其编码毒素蛋白ccdB，含有ccdB基因的质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体，将会导致宿主菌体的死亡。LacZα基因编码β-半乳糖苷酶(简称β-gal)。β-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。LacZα基因插入突变型ccdB基因中，破坏了突变型ccdB基因的编码序列，使其不能表达ccdB蛋白(如图1和6所示)。

[0015] DNA聚合酶扩增LacZα基因，并将其连接到含有突变型ccdB基因的质粒中，然后将质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体。当LacZα基因不能插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因表达ccdB蛋白，会造成宿主菌体的死亡；当LacZα基因插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因不表达ccdB蛋白，而表达β-gal，如果LacZα基因无突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色(蓝斑)，如果LacZα基因有突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈白色(白斑)，白斑数量与蓝斑数量之和为总菌斑数量。白斑数量越多，则DNA聚合酶的错配率越高，反之则越低。

[0016] 错配率直接反映DNA聚合酶的保真性—错配率越高，保真性越低。因此可以直接将错配率作为保真性的评价指标。在PCR体系与条件相同的情况下，用不同PCR酶扩增LacZα基因(如图5所示)并完成上述实验，便可以根据数据比较不同DNA聚合酶的保真性。即DNA聚合酶的错配率计算方法为：

碱基数×循环数

[0017] (1-错配率)＝蓝斑数/总菌斑数[0018] 将上式变形，最终可得：

[0019]

其中，步骤(1)中含有突变型ccdB基因的质粒构建方法可采用常规的构建方法，如对含有野生型ccdB基因的质粒进行点突变，或通过PCR的方法突变野生型ccdB基因以获得突变型ccdB基因，然后将突变型ccdB基因的PCR产物或其内切酶酶切产物连接到载体上，或者通过基因重组的方法连接到载体上，或者其他能够实现相同目的的实验手段，其中所述载体不含有可表达ccdB蛋白的基因，或可表达与ccdB蛋白相同功能产物的基因。

[0020]

优选地，步骤4)所述LacZα基因连接到所述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。通过基因重组，所述LacZα基因插入到突变型ccdB基因中。其中所

[0021]

述LacZα基因的DNA序列见序列表SEQ ID No.1。[0022] 优选地，步骤1)所述的质粒不表达抗ccdB蛋白毒性的基因。[0023] 优选地，步骤2)中酶切时内切酶识别的位点为步骤1)引入的酶切位点。[0024] 优选地，步骤5)所述宿主菌为对ccdB蛋白毒性无抗性的细菌，更优选为对ccdB蛋白无抗性的大肠杆菌，如DH5α、Top10或Trans1-T1。

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说 明 书

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优选地，步骤5)所述培养基为固体培养基。优选地所述培养基含有X-gal和IPTG，其中X-gal和IPTG的用量为本领域的常规用量。宿主菌的培养时间根据菌体性质决定。培养结束后分别计算其中蓝斑和白斑的数量，蓝斑和白斑的数量之和为总菌斑数量。所述错配率的计算方法为：

碱基数×循环数

[0026] (1-错配率)＝蓝斑数/总菌斑数[0027] 将上式变形，最终可得：

[0028]

本发明的有益效果如下：[0030] 与传统方法相比，本发明提供的一种将LacZα基因插入突变型ccdB基因的DNA聚合酶错配率检测方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。

[0029]

附图说明

[0031] [0032]

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出制备方法原理图

[0033] 图2示出pEASY-Blunt Zero Cloning Vector质粒结构。

[0034] 图3示出缺失LacZα基因后的pEASY-Blunt Zero Cloning Vector(记为Plasmid 1)质粒结构。

[0035] 图4示出突变后的Plasmid 1质粒结构。

[0036]

图5示出LacZα基因的PCR扩增产物。

[0038] 图6示出LacZα基因在突变产生的酶切位点处插入ccdB基因后，生成的重组质粒。

[0037]

具体实施方式

[0039] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非性的，不应以此本发明的保护范围。[0040] 实施例中所用的材料及来源分别为：pEASY-Blunt Zero Cloning Vector、EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase、TransStart FastPfu DNA Polymerase、Fast Mutagenesis System、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、T4DNA Ligase、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell(北京全式金生物技术有限公司)，SmaI、EcoRV性内切酶(NEB公司)，One

ccdB SurvivalTM2T1R Competent Cells(感受态细胞)、引物合成、测序(Life

technologies公司)。[0041] 实施例1：DNA聚合酶错配率的检测[0042] 1.制备含有野生型ccdB基因的质粒[0043] 用反向PCR然后自连的方法，缺失pEASY-Blunt Zero Cloning Vector载体中的

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说 明 书

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LacZα基因，仅保留载体上的野生型ccdB基因。[0044] 反向PCR引物为5’磷酸化引物，序列如下：[0045] Plasmid 1Primer F：5’-CAGTTTAAGGTTTACACC-3’(见序列表SEQ ID No.3)[0046] Plasmid 1Primer R：5’-CATAGCTGTTTCCTGTGTG-3’(见序列表SEQ ID No.4)[0047] pEASY-Blunt Zero Cloning Vector为模板(Template)，其含有LacZα与ccdB的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR反应体系如下：

[0048]

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃1分钟，共25个循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。[0050] 然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化PCR产物，用T4DNA Ligase

[0049]

自连，转化One

ccdB SurvivalTM2T1R Competent Cells(感受态细胞)，挑单克隆，

测序验证，对测序正确的菌落提质粒，质粒记为Plasmid 1。[0051] 2.含有突变型ccdB基因的质粒的构建：

[0052] 在野生型ccdB基因中突变产生SmaI酶切位点。[0053] 野生型ccdB基因突变引物如下：[00] Mutation Forward Primer:5’-GATATTATTGACACCCCGGGGCGACG-3’(见序列表SEQ ID No.5)

[0055] Mutation Reverse Primer:5’-GGTGTCAATAATATCACTCTGTACA-3’(见序列表SEQ ID No.6)

[0056] Plasmid 1为模板(Template)，其含有野生型ccdB基因，质粒结构如图3所示，突变反应体系如下：

[0057]

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃1分钟，共25个

循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0058] [0059]

然后用DMT酶(或DpnⅠ酶)消化PCR产物，取2μl酶消化产物，转化One

ccdB SurvivalTM2T1R Competent Cells(感受态细胞)，挑单克隆，测序验证，对测序正确的菌落提质粒，其中突变型ccdB基因的DNA序列见序列表SEQ ID No.7。

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CN 1044221 A[0060]

说 明 书

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3.制备线性化质粒：

[0061] 用SmaI内切酶酶切含有突变型ccdB基因的质粒，电泳检测酶切效果；然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化酶切产物，即得到线性化质粒。[0062] 4.扩增LacZα基因

[0063] 根据SEQ ID No.1中LacZα基因序列设计引物，在下述引物序列中，斜体且加下划线的DNA序列为所述质粒上SmaI酶切位点两侧序列，在LacZα基因两侧引入后，以便进行后续重组实验。

[00] LacZαForward Primer:[0065] 5’-GATATTATTGACACCCCGACCATGATTACGCCAAGC-3’(见序列表SEQ ID No.8)[0066] LacZαReverse Primer:[0067] 5’-CACCATCCGTCGCCCCTTCATTACCGTACGTATAGGCTGC-3’(见序列表SEQ ID No.9)[0068] 以pEASY-Blunt Zero Cloning Vector为模板(Template)，其含有LacZα与ccdB的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR体系如下：[0069] PCR反应体系：

[0070]

其中DNA聚合酶为EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase或

TransStart FastPfu DNA Polymerase。[0072] PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃20秒，共30个循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化扩增产物。[0073] 5.基因重组，转化

[0074] 用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(试剂盒)，将步骤3制备的线性化质粒与步骤4制备的LacZα基因PCR产物连接起来，反应体系如下：

[0071] [0075]

50℃反应15分钟，然后取2μl连接产物转化Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell，并涂布于预先涂有X-Gal与IPTG的Kan+抗性LB琼脂糖平

[0076]

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说 明 书

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板上，过夜培养，计数蓝白斑，具体数据如下：

[0077]

6.计算突变率

[0079] 按照突变率计算公式，计算得到三种酶突变率具体数据如下：

-6

[0080] EasyTaq 18×10

-6

[0081] TransTaq HiFi 5.8×10

-6

[0082] TransStart 0.9×10[0083] 实施例2：

[0084] 1.制备含有野生型ccdB基因的质粒[0085] 同实施例1.

[0086] 2.含有突变型ccdB基因的质粒的构建：

[0087] 在野生型ccdB基因中突变产生EcoRV酶切位点。[0088] ccdB基因突变引物如下：[00] Mutation Forward Primer:5’-TGTACAGAGTGATATTATTGACACGC-3’(见序列表SEQ ID No.10)

[0090] Mutation Reverse Primer:5’-CCATCCGTCGCCCCGGCGTGTCAATG-3’(见序列表SEQ ID No.11)

[0091] 以Plasmid 1为模板(Template)，含有野生型ccdB基因，质粒结构如图3所示)，突变反应体系如下：

[0078] [0092]

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃1分钟，共25个

循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0093] [0094]

然后用DMT酶消化PCR产物，取2μl消化产物，转化OneccdB

SurvivalTM2T1R Competent Cells(感受态细胞)，挑单克隆，测序验证，对测序正确的菌落提质粒。其中突变型ccdB基因的DNA序列见序列表SEQ ID No.12。[0095] 3.制备线性化质粒：

[0096] 用EcoRV酶切上述含有同义ccdB基因的质粒，电泳检测酶切效果；然后对酶切产物去磷酸化。最后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit纯化反应产物，即得到线性化载体。

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说 明 书

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4.扩增LacZα基因

[0098] 根据LacZα基因序列设计并合成一对5’磷酸化引物：[0099] LacZαForward Primer:[0100] 5’-ACCATGATTACGCCAAGC-3’(见序列表SEQ ID No.13)[0101] LacZαReverse Primer:[0102] 5’-GTCATTACCGTACGTATAGGCTGC-3’(见序列表SEQ ID No.14)[0103] 以pEASY-Blunt Zero Cloning Vector为模板(Template)，其含有LacZα与ccdB的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR体系如下：[0104] PCR反应体系：

[0105]

其中DNA聚合酶为EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase或

TransStart FastPfu DNA Polymerase。[0107] PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃20秒，共30个循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit(试剂盒)纯化扩增产物。[0108] 5.连接，转化

[0109] 用T4DNA Ligase(DNA连接酶)，将步骤3制备的线性化载体与步骤4制备的LacZα基因连接起来，反应体系如下：

[0106] [0110]

25℃反应2小时，然后取2μl连接产物转化Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell(感受态细胞)，并涂布于预先涂有X-Gal与IPTG的Kan+抗性LB琼脂糖平板上，过夜培养，计数蓝白斑，具体数据如下：

[0111] [0112]

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说 明 书

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6.计算突变率

[0114] 按照突变率计算公式，计算得到三种酶突变率具体数据如下：

-5

[0115] EasyTaq 1.6×10

-6

[0116] TransTaq HiFi 5.9×10

-6

[0117] TransStart 1.1×10[0118] 实施例3：

[0119] 我们另用Stanislaw K、Brian J.Keith等的方法与Wayne M.Barne等的方法作为对照，同样测试了以上三种酶的突变率，记为传统方法1、传统方法2。具体实施方案参考背景技术中提及的文献资料进行实验。不同突变率检测方法的比较结果详见下面的表1。[0120] 表1.不同突变率检测方法比较

[0113] [0121]

EasyTaq突变率TransTaq HiFi突变率FastPfu突变率耗时费用[0122]

实施例11.8×10-55.8×10-69.0×10-75天～1000元

实施例21.6×10-55.9×10-61.1×10-65天～1000元

传统方法12.1×10-56.2×10-61.2×10-62周～9000元

传统方法21.1×10-53.6×10-66.5×10-710天～3500元

比较结论

[0123] 1、本发明的两个实施例，数据一致。[0124] 2、传统方法1与本发明相比，数据基本一致，但耗时较长且花费很高。[0125] 3、传统方法2与本发明相比，由于方法本身的缺陷，数据整体偏低，且耗时较长，花费较高。[0126] 4、综上，本发明与传统方法相比，数据准确，且具有操作简单、快速、成本低的特点。

[0127] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

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说 明 书 附 图

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图5

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