逝’江中医杂志２０１０年２月第４５卷第２期 ＲＰ—ＨＰＬＣ测定无刺枸骨不同部位中 齐墩果酸和熊果酸的含量 范志英 浙江省宁波市镇海区中医医院 浙江宁波 关键词 无刺枸骨 齐墩果酸 熊果酸反相高效液相色谱法光电二极管阵列检测器 枸骨（Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ Ｌｉｎｄ１．ｅｘ Ｐａｘｔ．）是冬青科冬青 泵，２９９６光电二极管阵列检测器，７７２５ｉ进样阀，Ｅｍ— 属植物，又名猫儿刺、鸟不宿。枸骨在我国分布较广， 长江中下游各省皆有分布，其叶呈小角刺状，枝、叶、 木、皮皆人药，有补肝肾、养气血、祛风湿、滋阴、益精、 ｐｏｗｅｒ中文色谱数据工作站）；Ｒ０～ＭＢ一１０Ｄ高纯水 机（杭州永洁达膜分离设备厂）；ＣＰ２２５Ｄ电子分析天平 （北京塞多利斯天平有限公司）；ＳＫ２５１０ＨＰ超声波清 洗器（上海科导超声仪器有限公司）。甲醇为色谱纯 活络的功能Ｌ１］。传统中医药理论认为，枸骨叶具有清 热养阴，平肝益肾，散风通络等功效，用于肺痨咯血，骨 蒸潮热，头晕目眩，高血压等症印］。枸骨中富含的齐墩 果酸（ＯＡ）和熊果酸（ＵＡ）等三萜酸类成分［３］，具有抗 菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖血脂等多种生理作用，已引 起人们广泛的兴趣和关注［４ ］。无刺枸骨（Ｉｌｅｘ Ｃｏｒｎｕｔａ Ｖａｒ．ｆｏｒｔｕｎｅｉ）是冬青属枸骨的自然变种，常绿灌木或 小乔木，其枝叶稠密，叶深绿光亮，人秋红果累累，经冬 不凋，鲜艳美丽，是良好的观叶、观果树种Ｌ６］，但无刺枸 （江苏汉邦科技有限公司）；齐墩果酸、熊果酸对照品 （中国药品生物制品检定所提供，批号分别为：１１０７０９ —２００３１１，１１０７４２—２００３１４）；无刺枸骨样品采自江西 省宜春市，经鉴定为冬青科冬青属植物Ｉｌｅｘ Ｃｏｒｕｎｔａ Ｖａｒ．｛ｏｒｔｕｎｅｉ。 ２方法与结果 ２．１ 色谱条件：色谱柱为Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８柱（４．６ｒａｍ× ２５０ｍｍ，５ ｍ）；流动相为甲醇一水一磷酸（９０：１０： ０．２，ｖ／ｖ／ｖ）；流速０．８ｍＬ・ｍｉｎ～；检测波长２１０ｎｍ；柱 骨的化学成分研究尚未见文献报道。本实验采用超声 辅助提取，建立反相高效液相色谱法同时测定了无刺 温为２５￣Ｃ。以齐墩果酸和熊果酸计，理论塔板数均大 于１２０００，齐墩果酸和熊果酸分离度大于１．８，对称因 枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量，旨在为无 刺枸骨的质量控制及其开发利用提供科学依据。 １仪器与试剂 子分别为１．０２、１．０１，外标法定量分析。对照品和样品 色谱见图１。 Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪（美国Ｗａｔｅｒｓ公司，５１５ ５．０ １０．０ １５．０ ２０．０ ２５．０ ５．０ １０．０ ｌ５．Ｏ ２０．０ ２５．０ 图１对照品（Ａ）和样品（Ｂ）的ＨＰＬＣ谱图 ２．２溶液配制：分述如下。 对照品２．７５ｍｇ、５．１０ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加流动相 溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含齐墩果酸０．２７５ｍｇ・ ２．２．１对照品溶液：分别精密称定齐墩果酸、熊果酸 浙江中医杂志２０１０年２月第４５卷第２期 ｍＬ一１和熊果酸０．５１０ｍｇ・ｍＬ 的对照品混合贮 备液。 表１无刺枸骨不同部位样品测定结果（ 一３） 部位 ＯＬＡ（％） ＲＳＤ（ ） ＵＡ（ ） ＲＳＤ（ ） ２．２．２样品溶液：取于６Ｏ℃干燥并粉碎过２０目筛的 无刺枸骨各部位原料药粉末约１～５ｇ，分别置于５０ｍＬ 具塞锥形瓶中，用９５ 乙醇５０ｍＬ超声提取４５ｍｉｎ，放 冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，用０．４５ 滤膜过滤即得。 ２．３峰纯度检测：当纯度角小于阈值时，在测量的噪 音内光谱是均匀的，为纯组分；当纯度角大于阈值时， 表示有共流出物存在。使用二极管阵列检测器在１９０ ４００ｎｍ波长范围内采集组分峰的３Ｄ图谱，峰纯度分 析条件为：检测波长１９０￣４００ｎｍ，最小分辨率１．２ｎｍ， 峰宽３０ｓ，基线噪音阈值５０ Ｖ・Ｓ，噪音间隔起止时间 ０．２５～０．７５ｍｉｎ。结果表明，对照品和样品溶液中齐墩 果酸和熊果酸的紫外光谱一致，最大吸收波长均为 果青红 果支嫩叶青叶老 叶 ２０２．２ｎｍ。纯度图中齐墩果酸和熊果酸峰的纯度线位 于自动阈值线下方，纯度角均小于阈值，表明齐墩果酸 和熊果酸色谱峰均为单一组分吸收峰，无其它组分的 干扰。 ２．４ 线性关系试验：精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照 品混合贮备液中２、６、１０、１５、２Ｏ Ｌ进样分析，按色谱条 件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为 纵坐标，绘制标准曲线，得齐墩果酸回归方程为：Ｙ一 ４．２７×１０ Ｘ一２．８４×１０ （ｒ一０．９９９９），熊果酸回归方 程为：Ｙ一４．５５×１０ Ｘ一１．７４×１０ （ｒ一０．９９９９）。表明 齐墩果酸进样量在０．５５～５．５０￣ｇ；熊果酸进样量在 １．０２～１０．２Ｏ ｇ时，线性关系良好。 ２．５精密度试验：分别精密吸取对照品混合贮备溶液 １０ Ｌ，平行进样５次，以峰面积计算色谱系统精密度， 齐墩果酸和熊果酸峰面积ＲＳＤ分别为０．６ （ 一５）和 ０．３ （ ＝＝＝５）。进样方法和仪器精密度良好。 ２．６重现性试验：取无刺枸骨叶样品５份，按样品溶 液制备方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液 １Ｏ Ｌ，进样，测定其峰面积积分值，外标法计算含量，齐 墩果酸和熊果酸含量的ＲＳＤ分别为２．１％（ 一５）和 １．８ （ 一５）。结果表明方法重现性良好。 ２．７加样回收率试验：精密称取已知齐墩果酸和熊果 酸含量的无刺枸骨叶样品６份，按高、中、低三种浓度 分别加入对照品适量，制备样品溶液，进样测定含量， 齐墩果酸平均回收率为９９．２％，ＲＳＤ为１．５％（ 一６）； 熊果酸平均回收率为９７．８％，ＲＳＤ为１．２％（ 一６）。 ２．８ 样品含量测定：精密吸取制备的样品溶液各 １０ Ｌ进样，测定齐墩果酸和熊果酸峰面积积分值，外 标法计算齐墩果酸和熊果酸的含量。测定结果见表１。 ３讨论 测定结果表明，在无刺枸骨不同部位中，叶中的齐 墩果酸和熊果酸含量均明显高于其他部位，而叶又以 嫩叶中２组分的含量最高。无刺枸骨不同部位的齐墩 果酸和熊果酸含量顺序均为：嫩叶＞叶＞枝＞果实，同 一部位中熊果酸含量均远高于齐墩果酸含量，可作为 提取分离熊果酸的优良原料。 二极管阵列检测器可以同时在设定波长区域内的 各波长下进行立体数据采集，既可以察看各波长下的 色谱图又可以察看各时间下的光谱图，在比对保留时 间的基础之上，加以光谱确认，可以克服仅以保留时间 一项指标定性的缺点，增强了定性的确定性。此外，二 极管阵列检测器与Ｅｍｐｏｗｅｒ色谱工作站系统适应性 软件联用，可分析组分色谱峰峰纯度，进一步增强色谱 方法的定性能力。 齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，结构与极性 均极其相似，在天然植物中往往共生互存，分离测定较 为困难。本试验建立的反向高效液相色谱法，可同时 测定无刺枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量， 由于样品处理简单，分离效果好，所以待测组分无其它 杂质的干扰。 ４参考文献 ［１］杨卫华，赵玉丛．中药枸骨叶化学成分和药理作用的研究进 展口］．医药世界，２００７（３）：１０３． ［２］江苏新医学院，中药大词典（下册）［Ｍ］．上海：上海科学技术 出版社，１９８６：１５２１． ［３］姚志容，李军，周思样，等．枸骨叶中的三萜类成分［Ｊ］．中国 中药杂志，２００９，３４（８）：９９９． ［４］李开泉，陈武，熊筱娟，等．乌索酸的化学、药理及临床应用进 展［Ｊ］．中成药，２００２，２４（９）：７０９—７１１． ［５］张奕颖，邓涛，胡志芳，等．熊果酸体外抗胃癌细胞ＳＧＣ７９０１ 机制的研究［Ｊ］．中草药，２００６，３７（４）：５５５． ［６］周财金．优良的观叶赏果树种——无刺枸骨［Ｊ］．中国花卉盆 景，２００７（１１）：３３． 收稿日期 ２００９—１１－１８
