２０１３年第４８卷第１２期 生物学通报 ｌ５ 对“对重叠延伸ＰＣＲ技术原理理解 及举例分析”一文的修正 刹、志涛 （湖北省仙桃中学 湖北仙桃４３３０００） 摘要 对２０１３年第３期《生物学通报》“对重叠延伸ＰＣＲ技术原理理解及举例分析”一文 中“重叠延伸ＰＣＲ技术的原理”部分错误进行了修正。找出了重叠延伸ＰＣＲ技术用于拼接２ 个基因时所用的关键引物之间及关键引物与待拼接的２个基因序列间的关系．并通过图示使 重叠延伸ＰＣＲ技术拼接２个基因的原理更直观、易懂。 关键词 重叠延伸ＰＣＲ 原理 基因拼接 中国图书分类号：ｏ７８ 文献标识码：Ａ 阅读了２０１３年第３期《生物学通报》上“对重 的Ｎ序列５ 端的互补序列。而原文中写的是“在 叠延伸ＰＣＲ技术原理理解及举例分析”这篇文章 设计的时候将Ｍ：的３ 端加入了２０个Ｎ基因５ 后，对ＰＣＲ技术有了进一步的了解。但是作者朱小 端的序列”。且不论这句话中“加入了２０个Ｎ基 燕老师在叙述重叠延伸ＰＣＲ技术的原理时。出现了 因５ 端的序列”的语意描述不够准确，这２Ｏ个脱 ２处错误，现对其进行修正，并用图直观展示重叠延 氧核苷酸所添加的位置也写错了，应该是加在５ 伸ＰＣＲ拼接２个基因的过程和各引物的特点。 端，而不是３ 端。 １ 部分原文展示 下面通过对重叠延伸ＰＣＲ拼接２个基因的 比如有２个基因，一个命名为Ｍ，一个命名为 原理的阐述．解释原文中这２个错误所在及进行 Ｎ．基因Ｍ和Ｎ的序列如下所示： 如上修正的原因。 Ｍ的序列为： ３ 重叠延伸ＰＣＲ拼接２个基因的原理 ５ 一ＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣ一３ 以原文中的Ｍ和Ｎ这２个基因为例介绍重 Ｎ的序列为： 叠延伸ＰＣＲ拼接２个基因的原理。 ５ 一ＡＴＧＣＴＡＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＴｒＩＴ丌ＴＡＡＡＡＣＧ一３ 基因的序列如下： 现在要将它们连接到一起．首先必须要设计 Ｍ的序列为： 引物．假设引物的序列为： ５ 一ＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣ一３ Ｍ，：５ 一ＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＴ一３ Ｎ的序列为： Ｍ２： ５ 一ＡＴＧＣｒＡＧＴＡＧＣｒＡＧＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＴｎＴｒＴＡＡＡＡＣＧ一３ ５ 一ＧＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＣＧＴ一３ Ｍ序列的互补序列为： Ｎ１： ５ 一ＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＣＧＴＡＧＣＧＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＴ一３ ５ 一ＡＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＴＡＧＴＡＧＣＴＡＧＧＧＧＧＧＧ一３ Ｎ序列的互补序列为： Ｎ２：５ 一ＣＧＴＩＴＩＴｒＡＡＡＡＡＡＴｒＡＴＣＣＣＣＴ一３ ５ 一ＣＧ１ＴＩ－Ｉ＇ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧＣＡＴ一３ ２ 原文中的错误及对错误的修正 正确的引物序列如下： 错误１：原文中在介绍重叠延伸ＰＣＲ技术的 Ｍ ：５ 一ＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＴ一３ 原理时，写出的引物Ｎ 序列有误。引物Ｎ 的３ 端 （共２１个碱基） 最后６个碱基应该是ＣＣＣＣＣＣ，而原文中是 Ｍ２： ＧＧＧＧＧＧ。 ５ 一ＧＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＣＧＴ一３ 错误２：原文中在介绍重叠延伸ＰＣＲ技术的 （共４Ｏ个碱基） 原理时，对引物Ｍ 的描述有误。设计引物Ｍ：时， Ｍ 倒过来： 应该是在Ｍ：的５ 端加入了２０个脱氧核苷酸长度 ３，一ＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＡ（ ＡＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＧＧ一５ １６ 生物学通报 ２０１３年第４８卷第１２期 Ｎ１： ５ 一ＡＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＴＡＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＣＣＣ一３ （共４０个碱基） Ｎ 倒过来： ３ 一ＣＣＣＣＣＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＡ一５ Ｎ２：５ 一ＣＧＴＩＴＩＴｒＡＡＡＡＡＡＴｒＡＴＣＣＣＣＴ一３ （共２１个碱基） 对引物的分析如下：这里关键的２个引物是 Ｍ：和Ｎ 。可以看出，Ｍ 的５ 端前２０个碱基与Ｎ 序列５ 端的前２０个碱基互补，而Ｍ 的后２０个碱 基与Ｍ序列的３ 端的前２０个碱基互补。如图１。 Ｉ庠刊 ’ ｃ ＧｃＴ４Ｇｉ４ｃ６ｃＩ｛ｃＧｃ ｃｃｃＣ％ｍ Ｉ：娜 ｃ Ｉ｛ ｃ㈣１ｃＧｉ１ｃＧ６ＧＧ ’ Ｉ制 眦【４Ｇ【４ ６ｃｃｃｃｃｃ ６Ｔｒｆ ＡＣＧ－３’ 图１ 对应序列的碱基互补 Ｎ 的５ 端前２０个碱基与Ｍ序列的３ 端前２０ 个碱基相同，即与Ｍ基因的另外一条链互补，Ｎ 的 后２０个碱基与Ｎ序列５ 端的前２０个碱基相同， 即与Ｎ基因的另外一条链互补。如图２和图３。 Ｉ序列５ 删瞄国Ｇ Ｃ￣ＡＣＥＴＡＣ∞ｆＧＡ ＣｃｃｃＣ１Ｇ脚０’ №５ ＣＧｃ１融ＣＴｋＣＣＣＣ僦ｉ１疆强勰Ｇｃ强Ｇｃｃ。ｃｃ：ｃ０’ Ｉ制５娟￡强国ＧＣ强ＧｃｃｅｃｃｃｃｃＡ 胛Ｉ＿ＩＴ琏ＡＡＡＣＧ－３ 图２对应序列的碱基相同 Ｍ 啪互｝ ９ ５ ４Ｉｅ∞ＧＧＧＧ阻 Ｇｃ ＧｃＧＴＩｃ强Ｇｃ强Ｏｅ Ｉ℃ｃ盯３ ３ 坝ＣｃｃＧｊＩＩｃ伽㈣ＣＴｋＧＴＣＣＣＣＣ￣ＴＣ孵１ＣＧＣｋ－５‘ 前悯互｛ Ｉ 图３对应序列的碱基互补 上图主要展示了Ｍ，和Ｎ 与Ｍ基因和Ｎ基 因相应序列的关系。另外，不难看出Ｍ，和Ｎ 这２ 个引物是完全互补配对的。如图４ ⅪＩ ５’￣－ＧＧＣＴｋ，Ｃ－ＣＴＡＣＴＡＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＲＲ￣ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＧＴ－３ Ｎｌ倒过来３’－ＣＣＣＣＣＣＧＡＴＣＧＡＴＣ￣ａ．ＴＣＧＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＡ一５’ 图４对应序列的碱基互补 Ｍ 和Ｍ序列的５ 端前２１个碱基相同。Ｎ，和 Ｎ序列的３ 端前２１个碱基互补。 重叠延伸ＰＣＲ拼接２个基因的步骤如下： 第１步：以引物Ｍ 和Ｍ 扩增Ｍ基因。如图５。 Ｍ，￣Ｊ ５‘椰 殉ｍＧＣⅨＧＡＡＣＯｅ强ｅＧｃＴＧＡＣ璐ｅ∞０ｅ１１ＧＡ ０ —呻 ．－一耻 ３’ ｅｍＡＴＧＧＧＧ雠强 Ｃ甜鼢舵ＧＡ丁ｃＧＧＧＧＧ ＭＩ：５＇－ＡＴＧＣｋＴＣ，Ｃ￣ＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＴ－３’—－ ３＇－ＴＡＣＧ￣ｃＧ舭 髓眦融ｒ觚ＡＣ ＴＧＧＧＧＧＡＣ＇Ｃ￣Ｇ－５ Ｍ蒯的互补序列 图５ 第２步：以引物Ｎ。和Ｎ：扩增Ｎ基因。如图 ６。第１步和第２步应该在不同的反应体系中进 行。若放在同一体系中，Ｍ 和Ｎ 这２个引物会互 补配对在一起而失去作用。 坼列５ ⅨＴｋＧＩｋＧＣ？ｋＧＣＣＣＣＣＣＣＣｋＧＧＧＧ腮ＡＴｒｍ强ＡＡＡＣＧ－３’ ４－－－－３ ℃ＣＣ ＩＡＡＡＡＡ盯ＴＴＴＧｃ５’ Ｎ１：５ ＣＧ ｒＧｌＣ强ＣＣｅＣ ｆＧ４１ｃ４嗍ｌＧ］：ＡＧＣｎＧＣＣＣＣＣＣ－３：—啼 ．－一 Ｃ ＡＴｃ锄０ｓＧＧＧＧＧＧＴａ：ｃｃ强ＴＬｉＡＡＡＡＡＴ兀豫．５’ 蒯瓶｝ ｌ 图６ 第３步：回收以上２步扩增所得的Ｍ基因和 Ｎ基因。这里获得的Ｍ基因中新合成的Ｍ序列的 互补序列都含有引物Ｍ ，获得的Ｎ基因中新合成 的Ｎ序列都含有引物Ｎ 。所得结果如图７。 Ⅱ序列５ ｍＧ ＧＡＡｃＧｃ强ＣＧ∞ＧＡ ｅｃＣｃｅ％ Ｇ强Ｇｃ融ＧｃＣＣｃｃｃ０① ３ 强ｅ∞眦Ｑ盯ＣｒＴＧｃＧ ＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴｋＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＧＧ￣国 ％ＡＴＧＣＡＴＣ－，．Ｃ￣Ｃ．，ＣＴＡＧＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＩｋＣＣｃｃＣ１ＧＡ．Ｉｃ０’ ３ ⅨＣＧ强ｃＧＡ耳ＧＡｒｃｒｒ∞ ｌＴ（；ＣＧＡＣＴ强粥ＧＧＧＧＡＣ强昏５ 前悯互｝ 列 Ｎ序列５＇－ＡＴ６ＣＴＡＧＴｋＣ，ＣＴｋＧＣＣＣＣ：ＣＣＣＣＡＣ－ＧＧＧＡＴＡＡＵＴＦＴＴｋＡＡＡＣＧ．３ ３’ｍＣ鼬瓦ＡＴＣ强１１。ＧＧＧＧＧＧＧＧ１ 盟鲤！丛丛 ！！ ‘Ｘ： Ｎｌ ５’－ＡＣＣ－ＣＴＧＡＣＢ．ＣＣＣＣ ＡＴ（研 ＡＧＣＴｋＣ，ＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧＡＴｋＡＩＴＨ￣ａ，ＡＡＣＧ－３＠ ３ ｒＧＣＧＡｅ１ ｆ 珩＾ｃ强ＧｒＡｃ㈣ｃ舡ｃ姒ＩｃＧＧ【 Ｇ（姗ＧＩｃｃｃＣ瑚ＩＡＡＡＡＡ州ｎ Ｇｃ‘） 固 ｘ序列姐补 ０ 图７第１轮复制的结果 （上面的是第１步第１轮复制的结果、下面的是 第２步第１轮复制的结果） 第４步：以上述步骤获得的含Ｍ，的Ｍ基因 和含Ｎ 的Ｎ基因为模板，以Ｍ 和Ｎ 为引物，扩 增即可得到Ｍ＋Ｎ，这样就将Ｍ基因和Ｎ基因拼 接起来了。具体如下：扩增时，图７中的②链中含 有的Ｍ 和③链中含有的Ｎ 互补配对，然后以Ｍ 和Ｎ 为引物进行延伸，然后用ＤＮＡ连接酶连接 延伸后的２个缺口，即可得到Ｍ基因和Ｎ基因的 拼接产物，如图８。也可以是①链和④链配对，然 后在ＤＮＡ聚合酶作用下合成出Ｍ基因和Ｎ基因 的拼接产物，并且这样合成的时候不需要ＤＮＡ连 接酶和引物，如图９。 嬉困 ，——————————／＾ ——————一、 删 ＇－ＡＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＣＣ ——＼—————～、／—————— 礓因 图８ Ｍ基因和Ｎ基因的拼接产物 Ｉ鲷 ， ———————，＾、、———— ———、、 ， 、 ｑ！ｋＣＣＣＣＣ＇［Ｇ￣ＴＣｋＴＧＣＴｋＧＴｋＣＣＴｋＧＣＣＣＣＣＣ＿３’①—＋ ・一３。 ＧｃＧ＾ｅ砺姐 Ｇ。Ｇｓ ｅ强Ｇ［４ｃ越ｒｃＡ１ｃ僦ＫＧｃ ＧＧＧⅡ∞ｃ强丁ｒＡＡＡ姒 ｒｒｒｆＧｃ． ＠ ＼—————啪、／——————一／ 噶园 图９ Ｍ基因和Ｎ基因的拼接产物 主要参考文献 １ 朱小燕．对重叠延伸ＰＣＲ技术原理理解及举例分析．生物学 通报，２０１３，４８（３）：ｌ６一ｌ７． （Ｅ—ｍａｉｌ：ｂｉｏｔａｏ＠１６３．ｃｏｎ）
