成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞及与牙髓干细胞的共培养

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research

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成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞及 ·研究原著·

与牙髓干细胞的共培养 吕继忠(菏泽医学专科学校口腔教研室，山东省菏泽市 274000)

DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0902 ORCID: 0000-0003-2767-2248(吕继忠)

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小鼠成纤维细胞来源诱导性多能干细胞在牙髓血管再生过程中的作用 小鼠成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 血管内皮生长因子 牙髓干细胞 血管内皮样细胞 共培养体系 检测指标： 检测指标： (1)倒置相差显微镜观察细胞形态变化； qRT-PCR检测CD34、血管内 (2)ELISA检测内皮型一氧化氮合酶水平； 皮生长因子mRNA表达。 (3)qRT-PCR检测内皮素、前列环素mRNA表达； (4)Western blot检测内皮素、前列环素蛋白表达。 文题释义：

诱导性多能干细胞：是近年来通过将成体细胞重编程而获得的能分化成多种器官和组织细胞的多能干细胞，类似于胚胎干细胞和成体干细胞，但不涉及伦理问题，来源不受且更容易诱导定向分化，可以实现自体细胞移植，在再生医疗领域具有更广阔的应用前景。

恒牙牙髓血管再生：萌出时间较短的牙齿在形态结构上尚未发育完全被定义为年轻恒牙，创伤、龋病和畸形等因素均可导致牙髓感染、变性甚至坏死，严重影响恒牙牙根的正常发育成熟。牙髓血管再生术已经应用于临床治疗牙髓坏死，取得一定疗效。

摘要

背景：牙髓的血管重建是为组织工程牙髓再生提供养分与能量供给的重要环节。干细胞的选择和血管内皮样细胞的定向分化已经成为真正实现牙髓再生的重要研究方向。

目的：将小鼠成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞，探讨其与牙髓干细胞共培养促进血管新生的可行性。

方法：①采用酶消化法制备小鼠睾丸支持细胞饲养层；②外源添加血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导小鼠皮肤成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞并进行鉴定；③建立血管内皮样细胞与牙髓干细胞共培养体系，荧光实时定量PCR检测CD34、血管内皮生长因子mRNA的表达。 结果与结论：①诱导分化14 d后倒置显微镜下观察到细胞形态改变，呈现血管内皮形态；②流式细胞术鉴定诱导分化细胞CD31阳性，呈现内皮细胞表型；③诱导分化14 d后，培养液上清中内皮型一氧化氮合酶水平明显高于未分化细胞(P < 0.01)；④诱导分化14 d后，与未分化对照组相比，实验组细胞内皮素表达增高(P < 0.01)，前列环素表达降低(P < 0.01)；⑤血管内皮样细胞与牙髓干细胞共培养5 d后，与血管内皮样细胞单独培养组相比，共培养组CD34和血管内皮生长因子表达增高(P < 0.01)；⑥结果表明，小鼠成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞可以定向分化为血管内皮样细胞，与牙髓干细胞共培养后有形成血管的倾向。 关键词：

牙髓坏死；牙髓血管再生；诱导性多能干细胞；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；内皮细胞；血管内皮生长因子；牙髓干细胞；干细胞

主题词：

诱导多功能干细胞；内皮细胞；牙髓；干细胞；组织工程

缩略语：

诱导性多能干细胞：induced pluripotent stem cells，iPSCs

Fibroblasts-derived induced pluripotent stem cells in pulp revascularization:

differentiation into vascular endothelial cells and co-culture with dental pulp stem cells

Lü Ji-zhong (Department of Stomatology, Heze Medical College, Heze 274000, Shandong Province, China)

文章编号:2095-4344(2018)21-03371-05 吕继忠，菏泽医学专科学校口腔教研室，山东省菏泽市 274000

中图分类号:R394.2 文献标识码:B

稿件接受： 2018-06-02

Lü Ji-zhong, Department of Stomatology, Heze Medical College, Heze 274000, Shandong Province, China

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吕继忠. 成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞及与牙髓干细胞的共培养[J]. 中国组织工程研究，2018，22(21):3371-3375. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0902

Abstract

BACKGROUND: Dental pulp vascularization is an important process to provide nutrients and energy for the dental pulp regeneration. The choice of stem cells and their directional differentiation into vascular endothelial cells have become an important issue of research in the pulp regeneration.

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of mouse fibroblasts-derived induced pluripotent stem cells differentiating into vascular endothelial cells and forming new blood vessels by co-culture with dental pulp stem cells.

METHODS: (1) The feeder layer of mouse Sertoli cells was prepared by enzyme digestion. (2) Mouse fibroblasts-derived induced pluripotent stem cells were induced by vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor to differentiate into vascular endothelial cells, and differentiated cells were then identified. (3) The co-culture system of vascular endothelial cells and dental pulp stem cells was established. Real-time fluorescence quantitative real-time PCR was used to detect mRNA expression of CD34 and vascular endothelial growth factor in the two groups.

RESULTS AND CONCLUSION: After 14 days of induced differentiation, the morphology of the vascular endothelium was visible under the inverted microscope. Flow cytometry results showed the differentiated cells were positive for CD31, indicating the phenotype of endothelial cells. Compared with the control group, the expression of endothelin and endothelial nitric oxide synthase increased (P < 0.01), and the

expression of prostacyclin decreased in the co-culture group at 14 days of induced differentiation (P < 0.01). Compared with the control group, the expression of CD34 and vascular endothelial growth factor increased at 5 days of co-culture (P < 0.01). These findings indicate that mouse fibroblasts-derived induced pluripotent stem cells can directionally differentiate into vascular endothelial cells and form new blood vessels by co-culture with dental pulp stem cells.

Subject headings: Induced Pluripotent Stem Cells; Endothelial Cells; Dental Pulp; Stem Cells; Tissue Engineering

0 引言 Introduction

牙髓是维持牙齿内环境稳态的惟一富含血管的结缔组织，在发生不可逆炎症感染时只能去除牙髓，而失去牙髓的牙齿成为死髓牙[1]。年轻恒牙的牙髓修复是目前口腔领域研究的热点问题，尤其是牙髓的血管再生治疗为发生牙髓坏死年轻恒牙的保留带来了希望[2]。但研究发现，牙髓血管再生治疗并没有实现牙髓组织的真正再生，没有形成牙髓牙本质复合体，只是在根管内壁和腔面形成牙骨质样、牙髓样和牙周膜样结缔组织，增加了根管钙化的风险，并且牙髓坏死清除后牙源性成体干细胞所剩无几，无法满足牙髓再生需要[3]。因此，选择何种干细胞和如何干细胞定向分化为血管内皮细胞，是实现年轻恒牙牙髓血管再生的重要问题。

目前，应用于组织工程血管化的内皮细胞来源主要包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)[4]。然而，由于供体组织来源的有限性、安全性、致瘤性、免疫排斥和伦理问题使胚胎干细胞和成体干细胞的广泛应用受到[5]。iPSCs最初是将皮肤成纤维细胞来源的体细胞重编程获得类似于胚胎干细胞特性的多能干细胞，已有多个实验室在小鼠、大鼠、猴和猪等物种中建立了iPS细胞系[6-9]。体细胞重编程技术日趋完善，已成功应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗，具有可操作性和稳定性，且安全性也在不断提高[10]。研究发现，自体来源的iPSCs能分化为多种细胞类型，可广泛应用于损伤或缺损组织的修复，并且iPSCs在特定的诱导条件可以在体外模拟胚胎发育，自发分化形成3个胚层[11]。也有研究表明iPSCs更容易被诱导重编程从而完成精确的定向分化，可明显降低成瘤风险[12]。因此，作者拟在无血清条件下诱导iPSCs定向分化为血管内皮样细胞并与牙髓干细胞共培养，观察促进牙髓血管再生的可行性。

1.2 时间及地点 实验于2015年12月至2017年2月在菏泽医学专科学校中心实验室完成。 1.3 材料

1.3.1 细胞 小鼠成纤维细胞来源iPSCs购于上海斯丹赛公司(货号：0203-001)。

1.3.2 实验动物 8 d龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK京2009-0004。

1.3.3 实验试剂 DMEM培养基(Gibco，美国)；Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶(Sigma，美国)；血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Cytokine，美国)；兔抗内皮素、兔抗前列环素、兔抗β-actin多克隆抗体(Santa Cruz，美国)；PrimeScript® Ⅱ High Fidelity RT-PCR试剂盒、SYBR® Premix DimerEraser®试剂盒(宝生物，大连)；小鼠内皮型一氧化氮合酶 ELISA试剂盒(默沙克，中国)；标准型Matrigel(BD，美国)。

1.3.4 实验仪器 CO2培养箱(Thermo，美国)；超净工作台(苏州净化设备厂，中国)；DM6000倒置显微镜(Leica，德国)；台式高速冷冻离心机(Thermo，美国)；酶标仪(BioTeK，美国)；梯度基因扩增仪(Biometra，德国)；Odyssey FC成像仪(Li-COR Biosciences，美国)；实时荧光定量PCR仪(ABI，美国)。 1.4 实验方法

1.4.1 乳鼠睾丸支持细胞分离与饲养层制备 选用10只C57BL/6J雄性乳鼠，处死后冰上快速取出双侧睾丸去除被膜，冰上剪碎加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴振荡 (80 r/min)，当组织呈悬浮絮状时加入DMEM培养基终止消化，离心(800 r/min)10 min去上清，加入0.1%透明质酸酶37 ℃水浴振荡(80 r/min)消化生精小管至短小片段，随后加入0.1%Ⅳ型胶原酶37 ℃水浴振荡(80 r/min)至大量细胞团出现，100目筛网过滤细胞，离心(1 000 r/min)5 min后重悬细胞，接种于培养瓶进行常规培养。支持细胞完全

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

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stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(21):3371-3375. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0902

贴壁后，用20 mmol/L的Tris-HCl 低渗处理去除生精细胞。将用超纯水以9∶1的比例新鲜配置的即用型胶原滴入细胞培养皿至全部覆盖皿底，37 ℃培养箱中放置12 h干燥，制成支持细胞饲养层。

1.4.2 iPSCs向血管内皮样细胞定向分化 实验分为对照组和诱导组。取生长状态良好的第3代已鉴定的小鼠皮肤成纤维细胞来源iPSCs，以1×105/mm2的密度将细胞接种于事先准备好的带有支持细胞饲养层的培养皿中，对照组只用DMEM培养液培养，诱导组在DMEM培养液中加入20 μg/L 血管内皮生长因子和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，每2 d不完全换液1次，两组连续培养14 d。 1.4.3 人牙髓干细胞与血管内皮样细胞共培养体系建立将事先配制好的Matrigel溶液平铺于培养皿底部，37 ℃恒温30 min后备用。将牙髓干细胞和诱导生成的血管内皮样细胞制成细胞悬液，以1∶1的比例混合接种至铺胶培养皿底部，常规培养5 d后提取细胞进行基因与蛋白检测，对照组为血管内皮样细胞单独培养，实验组为牙髓干细胞与血管内皮样细胞共培养。 1.5 主要观察指标

1.5.1 生化法检测细胞培养上清液中内皮型一氧化氮合酶水平 在iPSCs向血管内皮样细胞定向分化连续培养的14 d内，每次换液时将换下的培养液离心取上清液-80 ℃冻存，直到第14天收集全部培养液上清，按照说明书操作，酶标仪检测两组培养上清中内皮型一氧化氮合酶水平。 1.5.2 流式细胞术检测iPSCs向血管内皮样细胞定向分化前后CD31的表达 取定向分化培养第14天的细胞制成细胞悬液加入抗体孵育30 min，流式细胞仪检测CD31的表达。

1.5.3 荧光实时定量PCR检测分化细胞中内皮素和前列环素mRNA的表达和共培养体系中CD34、血管内皮生长因子mRNA的表达 取定向分化培养第14天的细胞和人牙髓干细胞与血管内皮样细胞共培养5 d的细胞，冰上Trizol法提取RNA，凝胶电泳判断提取质量，选择质量良好的RNA应用试剂盒进行反转录，所得cDNA作为模板，应用SYBR® Premix DimerEraser®试剂盒进行扩增反应，绘制扩增曲线和熔解曲线，以GAPDH作为对照。 基因引物 基因名称

引物序列(5’→3’)

内皮素

F TCC TCC TGC TCG TCG CTG ATC GAT AAA GAC

R TGT CAC ATC ACG CTC TCT GGA GGC CTG 前列环素

F AGG CGC GAC TCA AAA ACA TGC R CGT TGT AAG TCG TTC GAC CG CD34 F CCA ACG CAG GAC ACG TAA TG R GCA CAG TCC TCA GCG TTG CA 血管内皮生长因子

F GAA GAA CGA AAC GCC AAG AAA R GCC GGC ACG AAG CTA GA C GAPDH

F GCG CAT CAC CAT CTT CCA G

R TGA GCG CTT CCA CAA TGC G

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1.5.4 Western blot检测定向分化细胞中内皮素及前列环素蛋白的表达 取定向分化培养第14天的细胞，加入全细胞裂解液冰上裂解提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，各组蛋白上样，配制SDS-PAGE胶进行分离和转膜，3%BSA室温封闭1 h，去除封闭液，分别加入3%BSA稀释的内皮素(1∶200)、前列环素(1∶100)和β-actin多克隆抗体 (1∶1 000)，4 ℃过夜，次日加入相应二抗(1∶200)，室温摇床孵育1 h，化学发光显色，用目的条带灰度值比β-actin条带灰度值计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件分析实验结果，计量资料用x_

±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t 检验，显著性水平α=0.05。

2 结果 Results

2.1 倒置相差显微镜下观察iPSCs向血管内皮样细胞定向分化前后的细胞形态 复苏后的小鼠皮肤成纤维细胞来源的iPSCs呈形态均一的长梭形，细胞核呈卵圆形(图1A)。定向分化培养第14天，细胞达到85%融合，呈铺路石状单层排列，细胞呈多边形，突起增多(图1B)。

2.2 ELISA法检测分化前后细胞培养上清中内皮型一氧化氮合酶水平 培养第14天，实验组细胞培养上清中内皮型一氧化氮合酶水平显著高于对照组[(30.±1.72) U/mL，(11.33±0.75) U/mL，P < 0.05]。

2.3 流式细胞术检测定向分化前后细胞中CD31的表达对照组未分化细胞CD31阴性表达，实验组分化细胞CD31阳性表达，阳性率为42.71%。

2.4 荧光实时定量PCR检测分化细胞中内皮素和前列环素mRNA的表达和共培养体系中CD34、血管内皮生长因子mRNA的表达 定向分化培养第14天，与对照组相比，实验组内皮素mRNA表达明显升高(P < 0.01)，前列环素mRNA表达明显降低(P < 0.01)，见表1。人牙髓干细胞与血管内皮样细胞共培养5 d，共培养组CD34、血管内皮生长因子mRNA表达明显升高(P < 0.01)，见表2。 2.5 Western blot检测定向分化细胞中内皮素及前列环素蛋白的表达 定向分化培养第14天，与对照组相比，实验组内皮素的蛋白表达明显升高(P < 0.01)，前列环素的蛋白表达明显降低(P < 0.01)，见图2。

3 讨论 Discussion

目前临床上应用组织工程原理进行牙髓再生主要包括2种途径，一是通过使根尖部出血形成的血凝块诱导原位细胞进行迁移和分化，实现牙髓的血管再生，牙髓腔内新生的活性组织为牙根的继续发育提供保证；二是将干细胞和生物支架一起移植到根管，诱导干细胞分化，完成牙本质牙髓的再生[1]。血管系统是人体胚胎发育过程中最早发生且执行功能的器官系统，胚胎时期来源于中胚层的内皮细胞聚集形成血管并交织成网，发育后期或成年期新生血

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吕继忠. 成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞及与牙髓干细胞的共培养[J]. 中国组织工程研究，2018，22(21):3371-3375. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0902

表1 qRT-PCR 检测分化细胞中内皮素和前列环素mRNA的表达 (x_

±s)

Table 1

The mRNA expressions of endothelin and prostacyclin in

the cells detected by qRT-PCR

指标

对照组 实验组 P值 内皮素

1.00±0.00 3.79±0.26 0.000 前列环素

1.00±0.00

0.15±0.01

0.006

图1 倒置相差显微镜下观察诱导性多能干细胞向血管内皮样细胞定向分化前后的细胞形态 (×200) Figure 1 Morphology of induced pluripotent stem cells

differentiating into vascular endothelial cells under inverted phase

contrast microscope (×

200)

图注： 图中A为复苏后的小鼠皮肤成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞，呈形态均一的长梭形；

B为定向分化培养第14天，细胞达到85%融合，呈铺路石状单层排列，细胞呈多边形。

管则由现存的血管以出芽的方式形成，牙髓内的血管发生也不例外，牙髓组织同样来源于胚胎时期的中胚层[13]。功能正常的血管系统对牙齿的发育与修复至关重要，可以为牙齿提供营养与氧气，并将代谢产物和二氧化碳进行清除，而发挥重要作用的血管存在于牙髓组织内，被坚硬的牙本质壁包围，仅通过根尖孔与外界相通。由于结构的特殊性，使得实现牙髓组织再生具有局限性。有研究者通过培养切片法发现在牙齿发育过程中，牙胚的血管发生过程与人胚血管系统的建立过程相同。牙齿组织工程与牙齿发育过程相似，体外培养时，细胞可以通过扩散作用获得氧气与营养物质，而移植入体内时，单纯扩散不能满足牙胚继续发育的营养所需，血管化成为牙胚继续发育的必要条件，而此过程中侵入宿主脉管系统的血管化结构的形成过程正是血管再生[1]。有研究发现，将牙髓来源干细胞与人脐静脉内皮前体细胞共培养可以形成血管网，证实牙髓来源干细胞具有旁分泌促进血管再生的活性，使牙髓来源干细胞与血管内皮细胞共移植实现牙髓再生成为可能[14]。该研究结果显示，诱导分化14 d以后倒置显微镜下观察到细胞形态改变，呈现血管内皮形态；流式细胞术鉴定分化细胞CD31阳性，呈现内皮细胞表型；培养液上清中出现了主要存在于内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶，随培养时间延长其含量逐渐升高，表明成纤维细胞来源的iPSCs具有向血管内皮样细胞分化的倾向，与其他研究结果一致。实验采用小鼠同源的睾丸支持细胞作为饲养层，使细胞的诱导分化可以在不添加动物血清的条件下进行，避免了动物来源血清引起免疫反应的不良影响。

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表2 qRT-PCR 检测共培养体系中CD34、血管内皮生长因子mRNA

的表达 (x_

±s) Table 2 The expressions of CD34 and vascular endothelial growth factor in two groups by qRT-PCR

指标 对照组 共培养组 P值 CD34

1.00±0.00 1.45±0.04 0.007 血管内皮生长因子 1.00±0.00

3.51±0.19

0.000

1.0

对照组

对照组 实验组

量0.8 a

实验组

内皮素 达表0.6 前列环素 对相白0.4 β-actin

蛋0.2 a

0

内皮素 前列环素

图2 Western blot检测定向分化细胞中内皮素及前列环素蛋白的表达

Figure 2 The expressions of endothelin and prostacyclin proteins detected by western blot

图注：与对照组比较，aP < 0.01。

血管内皮生长因子是迄今为止发现的作用最强的促进血管生成因子，可以促进内皮细胞增殖、迁移并形成血管管腔样结构，同时也发挥维持内皮细胞正常结构与功能的作用[15]。该研究将血管内皮生长因子作为诱导分化的细胞因子，在碱性成纤维细胞生长因子的辅助下促进iPSCs向内皮细胞分化，结果表明外源加入血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子可以使成纤维细胞来源的iPSCs向血管内皮样细胞分化，与其他学者研究一致。然而，关于分化后的血管内皮样细胞功能的鉴定方法尚未见报道。该研究除了检测培养上清中的内皮型一氧化氮合酶水平，还结合检测了内皮细胞相关因子蛋白与mRNA的表达。内皮素作为内皮源性收缩因子，前列环素属于内皮源性舒张因子，二者达到平衡才能促进内皮细胞的生长与修复，通常认为内皮素升高同时前列环素降低保持正常的比例可以维持内皮细胞微环境稳态[16]。该研究结果显示，内皮素的基因与蛋白表达均在分化过程中增高，而前列环素基因与蛋白的表达下降，说明iPSCs定向分化的细胞与血管内皮细胞内两种因子分泌的情况一致，进一步验证分化细胞是血管内皮样细胞。

研究发现，CD34常常表达于正常的或新生的血管内皮细胞上，可以作为敏感的血管标记物[17]。该研究建立牙髓干细胞与分化的血管内皮样细胞共培养体系，在培养5 d后检测到培养物中有血管内皮生长因子和CD34的表达，说明共培养体系内有内皮细胞聚集形成血管的倾向。 综上所述，以睾丸支持细胞为饲养层同时加入血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，可以在无外源动

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物血清的条件下体外诱导小鼠成纤维细胞来源的iPSCs向血管内皮细胞定向分化，将分化细胞与牙髓干细胞共培养，结果初步显示内皮样细胞有形成血管的倾向，但诱导后的血管与正常血管的结构与功能是否一致，还需要进一步研究。

作者贡献：实验设计、实施、评估为吕继忠。 经费支持：该文章没有接受任何经费支持。 利益冲突：作者声明在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

伦理问题：研究用动物组织的实验方案符合相关伦理学要求，文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。 写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

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