内毒素方法验证方案

一、验证目的

氯化钠注射液细菌内毒素分析方法 验证方案/ZL 页码 1/6 确保氯化钠注射液细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。 二、适用范围

适用于本公司氯化钠注射液的细菌内毒素检测方法。 三、职责 部门 责任人 职责 方案起草 方案审核 方案批准 检验、出报告 质量部 四、内容

1 实验材料及用具 1.1电子天平 1.2电热恒温干燥箱 1.3试管恒温仪 1.4水银温度计 1.5旋涡混合器 1.6鲎试剂 供应商: 批号： 灵敏度： 规格：

1.7细菌内毒素国家标准品

供应商:中国药品生物制品检定所提供 批号： 效价：

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氯化钠注射液细菌内毒素分析方法 验证方案/ZL 页码 2/6 1.8细菌内毒素检查用水 供应商: 批号： 规格：

1.9实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 2 实验准备

2.1玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用生活饮用水将残留洗液彻底洗净，再用注射用水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中，然后放置入电热恒温干燥箱。

2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置电热恒温干燥箱后，将电热恒温干燥箱调至250℃，待电热恒温干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待电热恒温干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用,否则须再次干烤。 3 具体验证步骤 3.1鲎试剂灵敏度复核

3.1.1目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确，并考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 3.1.2操作方法

3.1.2.1细菌内毒素标准溶液的制备

将1支细菌内毒素标准品（140EU/支）完全溶解于1ml细菌内毒素检查用水中(置漩涡混合器上混合15分钟)，其浓度为140EU/ml，用这个浓度连续稀释制备1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml (每步稀释过程均应在旋涡混合器上混合30秒钟)四个浓度的细菌内毒素标准浓度。 3.1.2.2鲎试剂灵敏度复核操作

取18支（0.1ml/支）待验证灵敏度的鲎试剂，加入适量的细菌内毒素检查用水，复溶备用。按鲎试剂灵敏度标示值，将16支试管排成4列，每列4支。每个浓度取每列１支(共4支)鲎试剂管，每管加0.1ml，即每一浓度平行做4管。阴性对照管：另取2支鲎试剂管，1支在试验开始时加0.1ml细菌内毒素检查用

标题 水。

氯化钠注射液细菌内毒素分析方法 验证方案/ZL 页码 3/6 加样结束后，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保持60±2分钟后，将试管轻轻取出。避免振动，将每管拿出并缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱为阳性。记录为(-)；未形成凝胶或凝胶不能保持完成并从管壁滑脱为阴性。记录为(+)。 3.1.2.3计算：如果最大浓度（1.0EU/ml）均为阳性，最低浓度（0.125 EU/ml） 均为阴性（阴性对照管均为阴性时试验有效），按下式计算：

λｃ=1g-1(∑X/4)

式中：X为终点浓度的对数值（lg）。

当λｃ在0.25EU/ml～1.0EU/ml (包括0.5λ和2.0λ)时,可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。 3.2干扰试验

3.2.1目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。 3.2.2操作方法 3.2.2.1供试品限值

中国药典2005年版二部要求，内毒素限值L＝0.5EU/ml。 3.2.2.2最大有效稀释倍数（MVD）的确定 按下试计算：

MVD＝CL/λ＝1.0(ml/ml)×0.5(EU/ml)/0.5(EU/ml)=1

式中：L为供试品的细菌内毒素限值， EU/ml；

C为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml； λ为鲎试剂的标示灵敏度，EU/ml。 3.3.2.3制备内毒素标准对照溶液

取1支细菌内毒素标准品（140EU/支），用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml（方法同3.1.2.1）。

3.3.2.4制备含内毒素的供试品溶液

直接取供试品备用，再用此稀释液将3.3.2.3中的同支细菌内毒素标准品

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氯化钠注射液细菌内毒素分析方法 验证方案/ZL 页码 4/6 稀释成4个浓度即1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的含内毒素的供试品溶液。 3.3.2.6鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 3.3.2.7加样

将准备好的鲎试剂取其中18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的内毒素标准溶液，另一列2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

将另外18支鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含0.1ml的1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的内毒素的供试品溶液，另一列2支加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。

加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。 3.3.2.8实验结果计算

如两组最大浓度(2.0λ=1.0EU/ml)均为阳性，最低浓度(0.25λ=0.125 EU/ml)均为阴性，阴性对照,4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et) 。

Es= lg-1 (∑Xs/4) Et= lg-1 (∑Xt/4)

式中：

Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。 3.3.2.9结果判断

判断标准：当Es在0.25EU/ml～1.0EU/ml（包括0.25EU/ml和1.0EU/ml）时，且Et在0.5 Es～2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。

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氯化钠注射液细菌内毒素分析方法 验证方案/ZL 页码 5/6 当Et不在0.5 Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。

3.4供试品细菌内毒素检查

取各批供试品做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验做2支阳性对照和2支阴性对照。 3.4.1操作方法 3.4.1.1试液制备

a.供试品溶液的制备：按照干扰实验确定的稀释倍数进行样品制备。 b.阳性对照溶液的制备 用检查用水将内毒素标准品稀释制成1.0EU/ml浓度的内毒素标准溶液（方法同3.1.2.1）。

c.供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液将内毒素标准品制成1.0EU/ml浓度的内毒素溶液。

d.阴性对照液用细菌内毒素检查用水 3.4.1.2鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

3.4.1.3加样 取8支溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。

3.4.1.4将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 3.4.2结果判断 3.4.2.1判断标准

当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2 管均为阳性，应认为不符合规定；如2 管中1管为阳性，1 管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时

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氯化钠注射液细菌内毒素分析方法 验证方案/ZL 页码 6/6 供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2 管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。 5.验证依据

5.1《药品生产验证指南》（2003年版） 5.2《中华人民共和国药典》（2005年版） 6.报告

在进行验证工作时，详细记录试验过程及结果。试验结束后，根据实验结果得出相应的结论。

四川XXX药业股份有限公司

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（ZL ）

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