豌豆基因组SSR标记在蚕豆中的通用性分析

豌豆基因组SSR标记在蚕豆中的通用性分析

作者：侯万伟 刘玉皎

来源：《湖北农业科学》2012年第01期

摘要：分析了２１对豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）基因组ＳＳＲ引物在１０个蚕豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）品种中的通用性。结果表明，豌豆基因组ＳＳＲ引物在蚕豆中的通用性达３８．１０％，有效引物在蚕豆品种中的多态性比例为１００％。

关键词：豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）；蚕豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）；ＳＳＲ；通用性

中图分类号：Ｓ６４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）01－0185-03

Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅａ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Horsebean

ＨＯＵ Wａｎ－ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｙｕ－ｊｉａｏ

（Ｑｉｎｇｈａｉ Ａｃａｄｅｍy ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ２１ pairs of ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ of ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ） ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ） ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｅａ ＳＳＲ ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ ｗａｓ ３８．１０％， ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＳＳＲ ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ ｗａｓ １００％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）； ｈｏｒｓｅｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）； ＳＳＲ； ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ

简单序列重复（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ），是一类由１～６个碱基组成的基序（ｍｏｔｉｆ）串联重复而成的ＤＮＡ序列，它在真核生物的基因组

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中广泛存在，其基序两端的序列多是相对保守的单拷贝序列［１］。与其他分子标记相比，ＳＳＲ标记具有数量丰富、等位基因变异多、共显性遗传、重复性强和对基因组有很好的覆盖性等特点，已被广泛应用于基因定位、品种鉴定、图谱构建、种子纯度检测及遗传多样性分析等［２－６］。ＳＳＲ引物的获得可以通过３条途径：一是在公共的序列数据库（ＧｅｎＢａｎｋ）里寻找微卫星序列；二是基因组文库的筛选；三是从近缘物种中获得已设计好的引物对［７］。为了降低ＳＳＲ引物的开发成本，近年来很多学者对ＳＳＲ引物在不同种、属物种间的通用性进行了深入研究［８－１6］。本研究对２１对豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）基因组ＳＳＲ引物在蚕豆中的通用性和多态性进行初步研究，以快速找出可用于蚕豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究的分子标记。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料

供试蚕豆品种为：青海９号、青海１１号、青海１２号、马牙、陵西一寸、法Ｄ、透心绿、双“０”、湟饲、１３０。使用ＺＯＮＧ等［１７］报道的２１对豌豆ＳＳＲ引物（表１），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 １．２ ＤＮＡ提取与ＳＳＲ分析

１．２．１ 蚕豆基因组ＤＮＡ提取 取蚕豆幼嫩叶片约１ ｇ，加液氮研磨至粉末状，加入装有０．８ ｍＬ ＤＮＡ提取缓冲液［１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）＋１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）＋２．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ＋２％ ＣＴＡＢ＋２％ ＰＶＰ］的１．５ ｍＬ离心管中，６５ ℃水浴４５ ｍｉｎ后加入等体积氯仿／异戊醇（体积比为２４∶１）混匀，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，将上清液转入另一离心管中，加入等体积无水乙醇。冰上静置２０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，用７５％乙醇清洗沉淀３次，风干后加入４００ μＬ ＴＥ溶解，－２０ ℃保存备用。

１．２．２ ＰＣＲ反应及产物检测 ＳＳＲ反应体系（２０ μＬ）包括Ｍｇ２＋ ２ μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１ Ｕ、ｄＮＴＰ各２００ μｍｏｌ／Ｌ、１０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各２ μＬ、模板ＤＮＡ ２００ ｎｇ。反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，复性１ ｍｉｎ（６０ ℃起，每循环降低１ ℃），７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，１０个循环；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５０ ℃复性１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，２２个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。

扩增产物中加入５ μＬ溴酚蓝混匀，取５ μＬ在６％非变性聚丙烯酰胺凝胶中２００ Ｖ恒电压电泳９０ ｍｉｎ。电泳结束后用蒸馏水漂洗凝胶２次；加入染色液（０．２％ＡｇＮＯ３＋１％冰醋酸＋１０％无水乙醇）银染１５ ｍｉｎ，然后用蒸馏水漂洗２次；加入显影液（１．５％ ＮａＯＨ＋０．５％甲醛）进行显色，记录结果并分析。

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２ 结果与分析

２．１ 豌豆基因组ＳＳＲ引物在蚕豆中的通用性

共有８对豌豆ＳＳＲ引物（ＰＢ１４、ＰＳＡＡ１８、ＰＳＡＤ８３、ＰＳＡＡ４５６、ＰＳＡＤ２８０、ＰＳＡＢ１０９、ＡＤ１００、ＡＡ３０３）可以在蚕豆基因组ＤＮＡ中稳定扩增，占引物总数的３８．１０％。这８对通用性ＳＳＲ引物中有２对来自第７连锁群（ＬＧ Ⅶ），２对来自第２连琐群（ＬＧ Ⅱ），１对来自第５连琐群（ＬＧ Ⅴ） 。这些通用性ＳＳＲ标记所在片段可能是基因组上相对保守的部分，没有发生遗传分化；也有可能是两个物种在进化过程中受到了共同的选择压力作用。

２．２ 通用性ＳＳＲ引物在蚕豆品种中的多态性

用８对通用性引物在１０个蚕豆品种的基因组ＤＮＡ中进行扩增（图１），结果显示８对引物均表现出多态性，多态性引物比率为１００％。这些多态性引物的等位变异数为３～１０个，平均每对引物有８个等位变异。说明这些引物在蚕豆上有丰富的多态性，可以用于蚕豆资源的遗传分析。 ３ 讨论

目前关于ＳＳＲ分子标记在属内不同物种甚至不同属物种间的通用性报道很多［８－１７］。利用ＳＳＲ的通用性获得分子标记，可以提高分子标记开发的效率，降低开发成本，丰富标记数量，这对植物种质资源研究，尤其是构建高密度遗传图谱及种质资源的收集、保存和评价都有重要的意义。在对特定物种基因组信息尚未充分了解的情况下，使用其近缘物种的ＳＳＲ引物是一条十分便利的途径。本研究获得了８对在豌豆和蚕豆间具有通用性的ＳＳＲ标记，不仅可以用来进行蚕豆种质资源遗传多样性分析、基因发掘、鉴定、标记辅助选择育种等研究，也可以作为蚕豆和豌豆比较基因组学研究等的有效工具。 参考文献：

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