耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及制备和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110982732 A(43)申请公布日 2020.04.10

(21)申请号 201911106185.3(22)申请日 2019.11.13

(83)生物保藏信息

CCTCC NO：M 2019726 2019.09.17(71)申请人 重庆理工大学

地址 4000 重庆市巴南区红光大道69号

附1号(72)发明人 赵天涛　刘毫　艾铄　张千　封丽　

滕亮　余欢　鲁登富　(74)专利代理机构 重庆志合专利事务所(普通

合伙) 50210

代理人 胡荣珲(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12N 1/36(2006.01)

()发明名称

耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及制备和应用(57)摘要

本发明涉及一种耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及制备和应用，所述所述复合菌剂包括醋酸钙-不动杆菌TNJ-1(Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、反硝化盐单胞菌(Halomonas denitrificans)、贪铜菌SWA1(Cupriavidus sp.SWA1)复合而成。本发明过四种微生物协同作用，可在好氧、高盐的条件下实现高氨氮废水的有效处理，同时可有效抵抗氯化物、重金属等有毒物质。

C02F 3/34(2006.01)

C12R 1/01(2006.01)C12R 1/38(2006.01)C02F 101/20(2006.01)C02F 101/16(2006.01)C02F 101/12(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图2页

CN 110982732 ACN 110982732 A

权　利　要　求　书

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1.一种耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括醋酸钙-不动杆菌TNJ-1(Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、反硝化盐单胞菌(Halomonas denitrificans)、贪铜菌SWA1(Cupriavidus sp.SWA1)复合而成。

2.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌SWA1的体积比为20～60％：10～50％：10～50％：5～30％。

3.根据权利要求1或2所述复合菌剂，其特征在于，所述醋酸钙-不动杆菌TNJ-1的保藏号为CCTCC M 2019726。

4.权利要求1-3任一所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，有以下步骤，1)菌种的驯化

在盐度5％的条件下，采用梯度浓度驯化的方法，对权利要求1-3任一所述各菌种在高盐条件下，进行高氨氮耐受性驯化；

2)菌种的扩大培养

以含碳化合物为碳源，在异养硝化培养基中分别对步骤1)驯化后的各菌种进行扩大培养；

3)复合菌剂的制备

取步骤2)所得的菌液，按权利要求2所述比例混合，得到种子液，种子液富集培养至OD600＝0.7±0.1，即得复合菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述盐度以NaCl计算。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述扩大培养的方法为：分别取经过高盐、高氨氮驯化后的醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌接种于已灭菌异养硝化培养基中，密封，在30℃、150r/min条件下振荡培养4d。

7.权利要求1-3任一所述耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在制备用于脱除高盐、高氨氮废水中的氨氮及氯化物、重金属的制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述高盐指总含盐质量分数＞1％，高氨氮指氨氮浓度＞200mg/L。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述氯化物、重金属分别为NaCl和Hg2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Cr3+离子化合物。

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耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及制备和

应用

技术领域

[0001]本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及制备和应用。

背景技术

[0002]近年来高氨氮废水(氨氮浓度＞200mg/L)日益增多，由于处理不当直接排入水体，导致了富营养化等现象日趋严重，造成水体质量恶化，进而污染土壤导致农作物减产和农产品品质降低，影响大气环境质量。生物脱氮以其无二次污染、经济和安全等优点被认为是目前最有效的水体除氮方法。但是，传统生物脱氮法无法直接处理高氨氮废水，往往需要与物化法相结合，主要在于高浓度氨氮释放的游离氨(NH3)可以通过细胞膜快速扩散至细胞内，毒害传统生物法中的硝化菌从而抑制生化反应。同时，高浓度盐分(以NaCl计，总含盐质量分数＞1％)对微生物的毒害作用也十分明显，高盐可改变微生物细胞的渗透压，致使微生物细胞破裂或抑制生长，从而影响有机物去除率、氨氮去除率。因此，在高盐条件下如何有效去除高浓度氨氮已成为传统生物法的巨大挑战。[0003]近年来，一类结合异养硝化-好氧反硝化的细菌受到越来越多的关注，异养硝化是微生物在利用有机底物的同时将铵态氮转化为羟胺、亚盐和盐的过程，好氧反硝化是微生物在好氧条件下以有机物为电子供体，利用氧和盐或亚盐为电子受体，将盐或亚盐还原为氮气和气态氮化物的过程。由于这类细菌独特的代谢途径使其可在好氧条件下实现氨氮和总氮同步脱除，最终氮素被转化成N2且无有毒副产物的积累。此外，研究者发现这类细菌在高氨氮、高盐、低温等极端环境中依然具备较强的生物活性，据报道 Zobellella ensis DN-7最高耐受氨氮可达2000mg/L，Acinetobacter sp.Y16 最低耐受温度为2℃，Vibrio diabolicus SF16在1-5％盐度下均可保持较高的氨氮去除率，但是这类细菌往往在单一的极端环境具有显著优势，通过制备复合菌剂可以同时实现多种功能的结合，可为异养硝化-好氧反硝化菌在复杂极端环境下的应用打开新思路，为新型生物脱氮技术的发展带来新途径。发明内容

[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种耐盐耐高氨氮的异养硝化- 好氧反硝化复合菌剂及制备和应用，通过四种微生物协同作用，可在好氧、高盐的条件下实现高氨氮废水的有效处理，同时可有效抵抗氯化物、重金属等有毒物质。[0005]本发明的技术方案是：

[0006]耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，包括醋酸钙-不动杆菌 TNJ-1(Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、反硝化盐单胞菌(Halomonas denitrificans)、贪铜菌SWA1(Cupriavidus sp.SWA1) 复合而成。[0007]所述醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌SWA1 的体

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积比为20～60％：10～50％：10～50％：5～30％。

[0008]所述醋酸钙-不动杆菌TNJ-1的保藏号为CCTCC M 2019726。[0009]上述复合菌剂的制备方法，有以下步骤，[0010]1)菌种的驯化

[0011]在盐度5％的条件下，采用梯度浓度驯化的方法，对权利要求1-3任一所述各菌种在高盐条件下，进行高氨氮耐受性驯化；[0012]2)菌种的扩大培养

[0013]以含碳化合物为碳源，在异养硝化培养基中分别对步骤1)驯化后的各菌种进行扩大培养；

[0014]3)复合菌剂的制备

[0015]取步骤2)所得的菌液，按权利要求2所述比例混合，得到种子液，种子液富集培养至OD600＝0.7±0.1，即得复合菌剂。[0016]步骤1)所述盐度以NaCl计算。

[0017]步骤2)中所述扩大培养的方法为：[0018]分别取经过高盐、高氨氮驯化后的醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌接种于已灭菌异养硝化培养基中，密封，在30℃、150 r/min条件下振荡培养4d。

[0019]上述耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在制备用于脱除高盐、高氨氮废水中的氨氮及氯化物、重金属的制剂中的应用。[0020]所述高盐指总含盐质量分数＞1％，高氨氮指氨氮浓度＞200mg/L。[0021]所述氯化物、重金属分别为NaCl和Hg2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Mn2+、 Ni2+、Zn2+、Cr3+等离子化合物。

[0022]醋酸钙-不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1，属于醋酸钙-不动杆菌属。菌落直径1-1.5mm左右，呈突起状，边缘整齐，表面有光泽，颜色为白色；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为30～35℃，pH为7～7.5。

[0023]本发明所述的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri(CICC 10402)，属于假单胞菌属。菌体大小(0.5～1)×(1.5～5)μm，菌落淡黄色，边缘不规则，表面有褶皱、湿润、半透明，革兰氏阴性、无芽孢的短杆状，最适宜生长温度为28℃，最适宜的pH值约为7。[0024]本发明所述的反硝化盐单胞菌Halomonas denitrificans(CICC 105)，属于假单胞菌属，专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞、有荚膜杆菌，呈杆状或略弯。菌体大小(0.5～1)×(1.5～4)μm，具端鞭毛，能运动，最佳生长温度为30℃。[0025]本发明所述的贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1，属于贪铜菌属，菌落直径1mm 左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～7.5。

[0026]本发明复合菌剂中的贪铜菌SWA1见授权公开号为“CN104830725A”的发明专利。[0027]复合菌剂中的施氏假单胞菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(编号CICC 10402)。

[0028]复合菌剂中的反硝化盐单胞菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心 (编号CICC 105)。

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复合菌剂中的醋酸钙不动杆菌TNJ-1的保藏号为CCTCC NO：M 2019726；分类命名

为：醋酸钙不动杆菌TNJ-1(Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1)，保藏日期：2019年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国. 武汉.武汉大学。

[0030]本发明提供的高盐条件去除高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，具有如下有益效果：[0031](1)本发明提供的复合菌剂在盐度5％(含盐量以NaCl计)的条件下依然可以快速生长，并长时间保持高活性，实现在高盐条件下的高效脱氮；[0032](2)本发明提供的复合菌剂在盐度5％条件下对高氨氮废水具有较强的耐受能力，能够在好氧、高盐的条件实现异养硝化好氧反硝化功能，达到有效去除高浓度氨氮和总氮的目的。[0033](3)本发明提供的复合菌剂使用方便、用量少，可直接投入水体中形成优势菌种高效去除水体中的总氮及氨氮，同时可有效抵抗氯化物、重金属等有毒物质。[0034]采用本发明复合菌剂能够有效解决高盐条件下，传统生物脱氮法处理高浓度氨氮废水存在的效果差、处理效率低以及处理成本高等问题。[0035]下面结合附图和具体实施例，对本发明作详细的说明。附图说明

[0036]图1为复合菌剂在盐度5％、氨氮浓度为400mg/L时，对氨氮和总氮的去除曲线图；[0037]图2为复合菌剂在不同盐度条件下对高氨氮去除曲线图；[0038]图3为复合菌剂对榨菜废水中氨氮去除曲线图。

具体实施方式[0039]1、实验材料

[0040]异养硝化培养基配方(1000mL)：(NH4)2SO4 2g，C6H12O6 10.g，NaCl 5g，微量元素50mL。调节异养硝化培养基的pH值至7.0。[0041]维量元素配方(1000mL)：K2HPO4 5.0g，MgSO4 7H2O 2.5g，FeSO4 7H2O 0.05g，MnSO4 4H2O 0.05g，CuSO4 0.2g，CdSO4 0.05g。[0042]碳源除了葡萄糖外，复合菌剂还可以直接利用乙醇、蔗糖、乙酸钠等常见碳源。[0043]其余试剂为市售分析纯产品。[0044]2、检测方法

[0045]菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为600nm。各污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》(第四版，中国环境科学出版社， 2002)。[0046]实施例1：异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备[0047]步骤1)菌种的驯化

[0048]醋酸钙-不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1高盐、高氨氮耐受性驯化：

[0049]取2mL菌液接种于盐度为5％已灭菌的100mL异养硝化培养基中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，每次传代通过不断提升异养硝化培养基中氨氮浓度来进行驯化，不同传代培养基中氨氮浓度分别为200mg/

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L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600 mg/L。[0050]施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri(CICC 10402)高盐、高氨氮耐受性驯化：[0051]取2mL菌液接种于盐度为5％已灭菌的100mL异养硝化培养基中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，每次传代通过不断提升异养硝化培养基中氨氮浓度来进行驯化，不同传代培养基中氨氮浓度分别为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600 mg/L。[0052]反硝化盐单胞菌Halomonas denitrificans(CICC 105)高盐、高氨氮耐受性驯化：

[0053]取2mL菌液接种于盐度为5％已灭菌的100mL异养硝化培养基中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，每次传代通过不断提升异养硝化培养基中氨氮浓度来进行驯化，不同传代培养基中氨氮浓度分别为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600 mg/L。[00]贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1高盐、高氨氮耐受性驯化：

[0055]取2mL菌液接种于盐度为5％已灭菌的100mL异养硝化培养基中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，每次传代通过不断提升异养硝化培养基中氨氮浓度来进行驯化，不同传代培养基中氨氮浓度分别为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600 mg/L。[0056]步骤2)菌种的扩大培养

[0057]醋酸钙-不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1的扩大培养方法：[0058]取10～20mL经过高盐、高氨氮驯化后的菌种液接种于装有1000mL已灭菌异养硝化培养基的2000mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养4d。[0059]施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri(CICC 10402)的扩大培养方法：[0060]取10～20mL经过高盐、高氨氮驯化后的菌种液接种于装有1000mL已灭菌异养硝化培养基的2000mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养4d。[0061]反硝化盐单胞菌Halomonas denitrificans(CICC 105)的扩大培养方法：[0062]取10～20mL经过高盐、高氨氮驯化后的菌种液接种于装有1000mL已灭菌异养硝化培养基的2000mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养4d。[0063]贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的扩大培养方法：[00]取10～20mL经过高盐、高氨氮驯化后的菌种液接种于装有1000mL已灭菌异养硝化培养基的2000mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养4d。[0065]3)复合菌剂的制备

[0066]取经过步骤2)扩大培养所得的醋酸钙-不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus TNJ-1菌液450mL，施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri(CICC 10402)菌液200 mL，反硝化盐单胞菌Halomonas denitrificans(CICC 105)菌液200mL，贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1菌液150mL，复配得到种子液。

[0067]取20mL种子液接种于装有1000mL已灭菌异养硝化培养基的2000mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养4d。当OD600值升至0.7之后达到平稳期，得到复合菌剂。

[0068]实施例2：复合菌剂在盐度5％条件下去除高氨氮实验

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首先在1000mL去离子水中分别加入K2HPO4 5.0g、MgSO4 7H2O 2.5g、 FeSO4 7H2O 

0.05g、MnSO4 4H2O 0.05g、CuSO4 0.2g、CdSO4 0.05g，配置成为微量元素溶液作为备用。然后在1000mL去离子水中分别加入(NH4)2SO4 2g、 C6H12O6 10.g、NaCl 5g，上述微量元素溶液50mL，配置成氨氮初始浓度为 400mg/L的异养硝化培养基，调节异养硝化培养基的pH值至7.0。

[0070]取100mL上述异样硝化培养基于250mL锥形瓶中，用微量移液器向瓶中加入2mL复合菌剂菌液(OD600为1-2)，复合菌剂中醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌SWA1的含量分别为50％、20％、20％、 10％，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min-1条件下培养，然后每隔24h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氨氮和总氮的含量，确定氨氮和总氮的去除效果，由图1可知，在盐度5％条件下复合菌剂氨氮去除率达到97％，总氮去除率可达86％。[0071]实施例3：复合菌剂在不同盐度条件下去除高氨氮实验[0072]首先在1000mL去离子水中分别加入K2HPO4 5.0g、MgSO4 7H2O 2.5g、 FeSO4 7H2O 0.05g、MnSO4 4H2O 0.05g、CuSO4 0.2g、CdSO4 0.05g，配置成为微量元素溶液作为备用。然后在1000mL去离子水中分别加入(NH4)2SO4 2g、 C6H12O6 10.g、NaCl 1g，上述微量元素溶液50mL，配置成氨氮浓度为400 mg/L、盐度为1％的异养硝化培养基。按上述方法，通过改变加入的NaCl重量为3g、5g、7g、9g，配置氨氮浓度为400mg/L、盐度分别为3％、5％、7％、9％的异养硝化培养基，并调节异养硝化培养基的pH值至7.0。

[0073]分别取100mL上述不同盐度的异养硝化培养基于250mL锥形瓶中，用微量移液器向瓶中加入2mL复合菌剂菌液(OD600为1-2)，复合菌剂中醋酸钙- 不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌SWA1的含量分别为 45％、20％、20％、15％，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min-1 条件下培养，然后每隔24h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氨氮的含量，确定氨氮的去除效果。由图2可知，复合菌剂在盐度为 1％-9％范围内均可实现氨氮的高效去除。[0074]实施例4：复合菌剂处理典型高盐榨菜废水实验[0075]取100mL榨菜废水(盐度13％，取自重庆涪陵区百胜镇新河流域榨菜废水) 于250mL锥形瓶中，用微量移液器向瓶中加入2mL复合菌剂菌液(OD600为 1-2)，复合菌剂中醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌SWA1的含量分别为45％、20％、20％、15％，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min-1条件下培养，然后每隔24h测定废水中氨氮的含量，确定氨氮的去除效果，由图3可知，复合菌剂可高效去除榨菜废水中的氨氮，去除率可达93％。[0076]申请人的实验验证，在其它条件不变的情况下，醋酸钙-不动杆菌TNJ-1、施氏假单胞菌、反硝化盐单胞菌、贪铜菌SWA1的复合比例为20～60％：10～ 50％：10～50％：5～30％，均能达到本发明的实验效果。复合菌剂与废水体积比为1：1～20％时，均能达到本发明的实验效果，综合考虑时间因素和经济性因素，复合菌剂体积为废水体积2.0～5.0％的比例时，高氨氮去除的效果最佳。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

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