・４６・ 生物学教学２０１６年（第４１卷）第１２期 “温度对酶活性影响’’实验的再探究 姚 舒 （首都师范大学生命科学学院北京１０００４８） 张 胜 （广东省深圳第三高级中学５１８１７２） 摘要“温度对酶活性影响”实验一直是中学生物学中重要的探究课题。本文梳理了传统实验方法存在的问题，参考美国生物 学教材，更换实验材料为儿茶酚以及儿茶酚氧化酶，并介绍实验探究具体方法。 关键词酶温度儿茶酚探究 １ 实验背景 １．１ 酶的概念在一定条件下，酶在生物体内或体外 均可催化各种生化反应。它与一般催化剂的共性在 于：都是通过降低化学反应的活化能而加速反应进行 （图１）；不能改变化学反应的平衡点；反应前后酶的质 量、性质不变Ｌ１ｊ。 １．２温度与酶催化反应的关系 酶催化底物反应以 效应物与酶活性有关基团的碰撞一络合一解离为基 础。从热力学的角度看，对于一个酶分子而言，只存在 “有活性”与“无活性”两种状态，不具有连续性。只有 当酶成为一个“群体”时，因受温度与ｐＨ的影响，有些 无酶催化的反应 有酶催化的反应 图１ 酶催化机理——降低反应所需活化能 随温度或ｐＨ变化的连续曲线Ｅ２ Ｊ。酶的最适温度并非 一ｏ⑤⑤ 酶的特征常数，并不固定，而与测定酶活力的时间长短 有关，因为酶可以短时间内耐受较高的温度。大多酶 在４０ｃＩ＝以上催化活力下降；６０ｏＣ一７０ｏＣ呈现可逆失活； 酶失活，有些酶仍有活性，才表现出来酶“群体”活性 ＺＺ：（２ＺＷ＋２ＺＷ）＝ＺＺ：４ＺＷ，故ＺＷ（早）：ＺＺ（６）＝４ ：１，后代雌雄比例为４：１，答案选Ｄ。 图２雌火鸡卵细胞的形成过程 表１ 利用棋盘法分析后代基因型 、＼卵细胞 极 ＼＼ ｌ Ｚ ２ Ｗ （≥｛一⑤⑤⑤ Ｂ．雌：雄＝１：２ Ｄ．雌：雄＝４：１ Ａ．雌：雄＝１：１ Ｃ．雌：雄＝１：０ １ Ｚ １ ＺＺ ２ ＺＷ 解析：雌性动物卵母细胞的减数是不连续的， 原始生殖细胞在进行减数时，卵母细胞内有一明 显的核称为生发泡（ＧＶ）。启动卵母细胞减数，生 发泡破裂，向卵周隙排出第１极体，即进入休止状态； ～＼卵细胞 ＼１ Ｗ ２ Ｚ １ Ｗ １ ｗｗ（致死） ２ ＺＷ 随后若有精子进人卵子受精或进行人工激活或外界环 境的刺激，启动卵母细胞继续第二次减数，经后期 和末期，向卵周隙排出第二极体，完成减数第二次分 裂。此时的卵细胞与该极体在膜联系上最紧密，如果 要发生孤雌生殖的话，卵细胞也只能与该极体发生融 合。结合例２中的图左和右，如果产生的卵细胞中含 例３（据２０１５年安徽卷改编）在火鸡（ＺＷ型性别 决定）中，有人发现少数雌鸡的卵细胞不与精子结合， 而与某一极体结合形成二倍体，且卵细胞只与次级卵 母细胞形成的极体结合，并能发育成正常个体（注： ｗＷ胚胎致死）。这种情况下，产生后代的雌雄比例是 （ ） ｚ，则由该次级卵母细胞形成的极体也为ｚ，结合后的 胚胎ｚｚ，为雌性；如果产生的卵细胞中含ｗ，则由该次 级卵母细胞形成的极体也为ｗ，结合的胚胎为ｗｗ， ｗｗ胚胎致死，答案选ｃ。 生物学教学２０１６年（第４１卷）第１２期 ７０％～８０￣Ｃ出现不可逆失活…。酶的变性有两方面 的原因：温度和时间。在高温下变性比较快，但在较低 温度下，变性也会缓慢发生 ｊ。在一般情况下，温度 对酶活性影响实验中将自变量设定为温度，由于时间 较短，不考虑时间对实验带来的影响。 ２实验常见问题及改进 ２．１ 实验原理不合理在碘一淀粉溶液中，由于配合 与吸附作用产生了蓝色的淀粉一碘包合物。但是，当 溶液温度升高时，淀粉的螺旋构象会遭到破坏，导致无 法继续保持与碘的吸附状态，蓝色因此褪去＿４ Ｊ。因 此，碘液不可在高温下检测淀粉。 ２．２ 实验过程的改进用列表显示操作步骤会使学 生一目了然，并在实验过程中进一步验证低温、高温对 酶活性的影响。通过对实验过程的再设计，可使学生 实验的成功率大大提高，并更为直观地验证酶的性质， 丰富实验教学内容Ｅ５ｊ。另外，底物淀粉和酶必须保存 在同一温度中，防止淀粉和酶混合在一起温度突然发 生变化，影响在冰浴和沸水浴中唾液淀粉酶的活 性［６ｌ。 ２．３ 新方法的尝试 有研究者尝试运用聚丙烯酰胺 凝胶电泳技术对反应后的样本进行分离实验，来探究 温度对酶活性的影响。由于蛋白酶活性在不同温度和 时间下强弱不同，使得底物蛋白被切割的条带在聚丙 烯酰胺凝胶上显示的粗细不同，据此可以判断酶活性 的强弱【 。该实验设计中涉及的几种实验材料对于 普通中学来说不容易获得，且凝胶电泳装置也并不常 见，因此不适宜推广。 ３温度对酶活性影响的再探究 参考美国主流生物学教材《生物实验手册》Ｃ８』，采 用儿茶酚溶液替代淀粉溶液设计探究实验。 ３．１ 实验原理儿茶酚氧化酶从土豆提取液中获得。 由于儿茶酚溶液为无色，苯醌为棕色，通过观察颜色变 化来定性判断反应进行的程度。同时，颜色的逐渐变 化可利用吸光度定量得出。 ３．２ 实验材料与方法 准备１％儿茶酚溶液、土豆提 取液、冰箱、水浴锅、试管架、试管。实验过程如下： （１）在４０ｃＣ和８０℃的水浴锅水浴或室温下以及 ４￣Ｃ冰箱中放置１个试管架。 （２）取７支试管，并在试管上部依次编号１～７。 （３）取１管马铃薯提取液和１管１％儿茶酚溶液。 （４）如表１所示，将蒸馏水，ｐＨ缓冲液和马铃薯提 取物添加到试管中，震荡马铃薯提取液至悬浮状态。 （５）将上述试管放在对应温度的水浴或冰箱里， 每支管在各自对应的温度下静置５ ｍｉｎ预热（预冷）。 将１至４号试管放到试管架置于室温环境中（约 －４７・ ２２％）或者２０℃的水浴锅中。 （６）如表１所示，向２号以及４～７号试管添加１％ 儿茶酚溶液。立即记录每支试管此时的颜色变化，并 在表１中记录。定性记录颜色变化，范围从０—５，０表 示没有颜色变化，５表示剧烈变化。 （７）在接下来的２０ ｍｉｎ，每隔５ ｍｉｎ观察记录一次 颜色的变化，每次观察完要迅速将试管放回原来的位 置（冰箱或水浴）。 （８）实验完毕后，清理实验台和实验材料，儿茶酚 必须倒入专门的废弃物容器中，不能直接倒入水池。 表１温度影响酶活性因素实验 试管 蒸馏水 ｐＨ ６ 土豆提取液（含 １％儿茶 温度 编号 缓冲液 儿茶酚氧化酶） 酚溶液 （℃） １ ２ ｍＬ １ ｍＬ ２０ ２ ｌ ｍＬ １ ｍＬ １ ｍＬ ２０ ３ １ ｍＬ ｌ ｍＬ ｌ ｍＬ ２０ ４ １ ｍＬ １ ｍＬ １ ｍＬ ２０ ５ １ ｍＬ ｌ ｍＬ ｌ ｍＬ ４ ６ ｌ ｍＬ ｌ ｍＬ １ ｍＬ ４０ ７ １ ｍＬ １ ｍＬ １ ｍＬ ８０ ４实验讨论 从表１可见，试管１和３不含底物，试管２虽然有 底物，不含酶。因此，试管１、２、３不会发生变化，保持 原来的透明无色不变；试管４、５、６、７中的底物和酶完 全相同，温度为自变量。儿茶酚氧化酶对温度敏感，最 适温度为１５￣Ｃ，到４５℃就完全失活。也有文献报道 ２２￣Ｃ为儿茶酚氧化酶的最适温度【 ，反应条件可能有 所差异。需要注意的是，在加入儿茶酚氧化酶之前需 提前预热反应系统到设定温度，减少酶加人之后还未 达到预设温度从而产生误差。 主要参考文献 ［１］陈清西．２０１０．酶学及其研究技术．厦门：厦门大学出版社，１，９— １１，１３７—１３８ ［２］朱满员．２０１５．从统计热力学看酶活性．生物学教学，４０（１）：７３ ［３］Ｈａｎｓ Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ．刘晓晴译．２００９．酶学实验手册，北京：化学工业 出版社，１９ ［４］周 庆．２０１４．酶的特性研究实验设计刍议．生物学教学，３９ （８）：５２ ［５］赵玉萍．２０１１．探究温度影响酶活性因素实验操作过程的再设 计．生物学教学，３６（１０）：３２ ［６］赵玉萍．２０１０．“温度对酶促反应的影响”实验的改进．生物学教 学，３５（１）：４２ ［７］和 渊．２０１５．温度对蛋白酶活性影响的实验探究．生物学通 报，５０（１１）：４５ ［８］Ｄａｒｒｅｌｌ Ｓ，Ｖｏｄｏｐｉｅｈ．２０１４．Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕＭ ｔｅｎ山ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＭｃＧｒａｗ—Ｈｉｌｌ，１１３～１２４ ［９］袁振远．１９８５．儿茶酚氧化酶的酶学特性．食品科学，（１）：５—６
