一种硫酸多黏菌素B的杂质及其制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1092086 A(43)申请公布日 2019.01.15

(21)申请号 201811018772.2(22)申请日 2018.09.03

(71)申请人 杭州中美华东制药有限公司

地址 310011 浙江省杭州市拱墅区莫干山

路866号(72)发明人 谭芳　李清　仲翔　王雪峰　

许乐义　(51)Int.Cl.

C07K 7/62(2006.01)C07K 1/14(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图2页

()发明名称

一种硫酸多黏菌素B的杂质及其制备方法(57)摘要

本发明公开了一种硫酸多黏菌素B的杂质D17及其分离制备方法。考察了不同温度、pH等条件下该杂质的增长情况。为控制该杂质含量，优化硫酸多黏菌素B的工业化生产，提高药品质量

提供了保障。

CN 1092086 ACN 1092086 A

权　利　要　求　书

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1.一种硫酸多黏菌素B的杂质D17，其结构如下：

2.一种如权利要求1所述的硫酸多黏菌素B的杂质D17的制备方法，其特征在于：向硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水使硫酸多黏菌素B发生降解。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：硫酸多黏菌素B水溶液的浓度与为5-15mg/ml。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：加入氨水后，调节溶液pH至6-11，降解温度为25-50℃，时间为0-42小时。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：加入氨水后，调节溶液pH至9.3，降解温度为33℃，时间为24小时。

6.一种如权利要求1所述的硫酸多黏菌素B的杂质D17的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤，

(1)、硫酸多黏菌素B成品溶于5％乙腈水溶液中，经高效制备液相分离得硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液；

(2)、向步骤(1)中所得杂质D17的浓溶液中加入氨水，析出白色沉淀，过滤，得沉淀。(3)、将步骤(2)得到的沉淀用水分散，滴加5％硫酸溶液调pH约为6.5，冷冻干燥，冻干后的固体即为硫酸多黏菌素B杂质D17。

7.如权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述高效液相制备分离所用的流动相为乙腈∶4.46g/L硫酸钠溶液(20∶80)。

8.如权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中加入氨水至pH为9-10。9.一种控制硫酸多黏菌素B中如权利要求1所述的杂质D17的方法，其特征在于：在用碱调节pH沉淀硫酸多黏菌素B时，一次性快速加入至析出硫酸多黏菌素B沉淀。

10.如权利要求1所述的硫酸多黏菌素B的杂质D17作为对照品的用途，用于检测硫酸多黏菌素B原料或制剂中杂质D17或其含量。

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一种硫酸多黏菌素B的杂质及其制备方法

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技术领域

[0001]本发明属于药物分析及质量控制技术领域，具体涉及一种硫酸多黏菌素B的杂质及其分离制备方法。

背景技术

[0002]硫酸多黏菌素作为一种早期的非核糖体类抗菌药物，曾广泛应用于临床抗革兰阴性菌的治疗，后因其抗菌谱窄，毒副作用较明显而被替代。目前随着全球范围内多重耐药革兰阴性菌感染率不断增长，硫酸多黏菌素作为治疗革兰阴性菌的最后一道防线而再次被重视。根据不同菌株产生化学结构不同，硫酸多黏菌素总共有30多种类型，主要分为A、B、C、D、E五种亚型，其基本结构均为类环状十肽序列，包括一个七肽环和一个三肽侧链。三肽侧链各带有一个含氨基酸残基端的脂肪酸尾链，残基端的不同氨基酸组成导致其化学结构不全相同，其为硫酸多黏菌素分型的主要依据。最终仅多黏菌素B及E因其良好的疗效和相对较高的安全性而应用于临床，其区别在于硫酸多黏菌素B的氨基酸成分为苯丙氨酸，而多黏菌素E则为亮氨酸。临床上常用的多黏菌素B、E均为混合物。[0003]硫酸多黏菌素B为发酵代谢产物，发酵液经纯化后得到构型相同的四个组分的硫酸多黏菌素B。在纯化硫酸多黏菌素B时会导致某些降解杂质含量升高，或产生新的降解杂质，但目前尚无关于硫酸多黏菌素B单个杂质的报道。为提高产品纯化工艺的可控性，保证产品质量，需要对产生的降解杂质进行研究。发明内容

[0004]本发明提供了一种新的硫酸多黏菌素B的杂质D17。该杂质在用碱调节pH沉淀硫酸多黏菌素B，以纯化硫酸多黏菌素B时，会不可避免地产生，且在硫酸多黏菌素B产品中含量较大。本申请分离制备出该杂质，对其进行了结构确认。并通过对硫酸多黏菌素B降解条件的研究，给出了控制该杂质生成的方法。

[0005]本发明的目的可通过以下技术方案实现：[0006]本发明提供了一种硫酸多黏菌素B的杂质D17，其结构如下：

[0007]

[0008]

该杂质在发酵液中未检出，但在硫酸多黏菌素B产品中会固定地出现，含量约0.6-0.8％。经检测，其相对保留时间为RRT1.16。后续研究发现，随着降解时体系环境不同，该杂

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质含量不同。

[0009]本发明还提供了一种硫酸多黏菌素B的杂质D17的制备方法，其特征在于：向硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水使硫酸多黏菌素B发生降解。[0010]在一种优选实施方式中，硫酸多黏菌素B水溶液的浓度为5-15mg/ml。[0011]在一种优选实施方式中，硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水后，调节溶液pH至6-11，降解温度为25-50℃，降解时间为0-42小时。[0012]在一种优选实施方式中，硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水后，调节溶液pH至9.3，降解温度为33℃，降解时间为24小时。

[0013]本发明的第三个目的在于提供一种硫酸多黏菌素B的杂质D17的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤，[0014](1)、将硫酸多黏菌素B成品溶于5％乙腈水溶液中，配制成上柱液。经高效制备液相分离得硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液；[0015](2)、向步骤(1)中所得硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液中加入氨水，析出白色沉淀，过滤，得沉淀。[0016](3)、将步骤(2)得到的沉淀用水分散，滴加5％硫酸溶液调pH约为6.5，冷冻干燥，冻干后的固体即为硫酸多黏菌素B杂质D17。[0017]在一种优选实施方式中，步骤(1)中所述高效液相制备分离所用的色谱柱为Xtimate C18(welch)，20*250nm，5um；流动相为乙腈：4.46g/L硫酸钠盐溶液(20∶80)；检测波长为215nm。

[0018]在一种优选实施方式中，步骤(2)中加入氨水至体系pH为9-10。[0019]本发明采用高分辨质谱、核磁等手段对分离得到的杂质D17进行了结构检测及确认。

[0020]本发明还提供一种控制硫酸多黏菌素B中杂质D17的方法，其特征在于：在用碱调节pH沉淀硫酸多黏菌素B时，一次性快速加入至析出硫酸多黏菌素B沉淀。[0021]本发明提供的硫酸多粘菌素B的杂质D17，其可作为标准对照品用于检测硫酸多黏菌素B原料或制剂中杂质D17及其含量。

[0022]本发明针对硫酸多黏菌素B特定单杂进行研究，提供了一种新的硫酸多黏菌素B杂质D17，其制备分离方法、含量控制方法及作为标准对照品的用途。为优化硫酸多黏菌素B的工业化生产提供了技术支持，也提高了硫酸多黏菌素B产品的质量，保证了该药品的安全有效性。

附图说明

[0023]图1：实施例1中所用硫酸多黏菌素B原料的液相色谱图；[0024]图2：硫酸多黏菌素B杂质D17的核磁共振氢谱；[0025]图3：硫酸多黏菌素B杂质D17的核磁共振碳谱；[0026]图4：硫酸多黏菌素B杂质D17的紫外光谱图；[0027]图5：实施例5中CD630批次硫酸多黏菌素B制剂的液相色谱图。[0028]具体实施方法

[0029]为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一

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步的说明，但具体的实施方式并不意味着对本发明有任何。[0030]本发明所用硫酸多粘菌素B及试剂均市售购得。[0031]实施例1分离纯化硫酸多黏菌素B杂质D17[0032]1、杂质D17的粗制

[0033]硫酸多黏菌素B溶于5％的乙腈溶液，用Agilent SD-1制备液相制备；色谱柱C18(5um，20×250mm)；流动相为乙腈∶硫酸钠盐溶液4.46g/L＝20∶80；检测波长215nm；流速25mL/min。收集馏分，并过C18制备色谱柱富集。用80％乙腈洗脱，收集杂质粗提品溶液。[0034]2、杂质D17的精制

[0035]将收集的杂质粗提品溶液在35℃下减压浓缩，除去其中的乙腈。将浓缩液再次上制备柱纯化，收集其中杂质D17含量大于90％的馏分并对其进行富集除盐，得到硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液。[0036]3、杂质D17的后处理

[0037]向硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液中加入氨水，调pH至9-10之间，析出白色沉淀，过滤，所得沉淀用水洗三次。得到的沉淀用水分散后，滴加5％稀硫酸溶液调pH至6.5左右，然后经冷冻干燥冻干，冻干后的固体即为硫酸多黏菌素B杂质D17。[0038]实施例2硫酸多黏菌素B杂质D17的结构鉴定[0039]将实施例1中所得杂质D17经高分辨质谱检测，结果如下：[0040]硫酸多黏菌素B杂质高分辨质谱m/z：1203.7587[M+H]+，1225.7408[M+Na]+。[0041]再将实施例1中所得杂质D17进行核磁检测，得到核磁共振氢谱和核磁共振碳谱，结果如下：[0042]1H NMR(600MHz，D2O)δ7.30(t，J＝7.2Hz，2H)，7.25(t，J＝7.2Hz，1H)，7.10(d，J＝7.2Hz，2H)，4.72(t，J＝7.2Hz，1H)，4.50(dd，J＝9.0，4.2Hz，1H)，4.45(dd，J＝9.6，4.2Hz，1H)，4.38(dd，J＝9.0，4.2Hz，1H)，4.29(d，J＝4.2Hz，1H)，4.23(dd，J＝9.6，3.0Hz，1H)，4.20(dd，J＝6.6，4.2Hz，1H)，4.14(dd，J＝6.6，4.2Hz，1H)，4.00(t，J＝7.8Hz，1H)，3.91(dd，J＝10.2，4.2Hz，1H)，3.90(m，1H)，3.(d，J＝4.8Hz，1H)，3.29(m，2H)，3.13(m，2H)，3.06(m，1H)，3.02(m，3H)，3.01(m，2H)，2.99(m，2H)，2.94(m，2H)，2.28(m，1H)，2.24(t，J＝7.2Hz，2H)，2.16(m，4H)，2.06(m，1H)，2.02(m，1H)，1.99(m，1H)，1.90(m，2H)，1.88(m，2H)，1.49(m，2H)，1.48(m，1H)，1.38(m，1H)，1.22(m，5H)，1.17(m，1H)，1.14(d，J＝6.6Hz，3H)，1.07(d，J＝6.6Hz，3H)，1.03(m，1H)，1.02(m，1H)，0.78(d，J＝7.2Hz，3H)，0.74(t，J＝7.8Hz，3H)，0.74(d，J＝2.4Hz，3H)，0.52(d，J＝2.4Hz，3H)。[0043]13C NMR(150MHz，D2O)δ177.，175.52，173.47，173.20，173.10，172.71，172.48，172.42，172.03，171.99，170.66，135.62，129.16，128.88，127.44，67.10，66.58，60.71，58.92，.82，53.60，52.05，51.69，51.28，51.09，50.99，50.77，39.13，37.85，36.81，36.40，36.31，36.28，35.，35.40，35.32，33.50，31.29，29.88，28.83，28.，28.48，28.43，27.81，25.73，25.60，23.97，22.18，20.66，19.07，18.78，18.，10.66。[0044]通过核磁共振氢谱和核磁共振碳谱推测出氢原子和碳原子位置归属，结合质谱信息即确认杂质D17的结构。杂质D17的结构式为：

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[0045]

实施例3硫酸多黏菌素B降解产生杂质D17因素的考察

[0047]1、溶液pH的影响[0048]称取2.0g样品，溶于200ml纯水中，搅拌使其溶解，每瓶5ml分装。取未调节pH(pH为6.5)及用氨水调pH分别为8.5、8.8、9.3、9.8、10.3的样品各4瓶。同一pH下的4份分别在33℃降解20min、1h、2h、4h后取样进行高效液相检测。[0049]色谱条件为：Agilent 1260高效液相色谱仪；[0050]色谱柱：Waters symmetry-C18 4.6mm×25cm；[0051]流动相：乙腈∶硫酸钠盐溶液(4.46g/L)＝20∶80；[0052]流速：1mL/min；[0053]柱温：30℃；[00]检测波长：215nm。[0055]统计杂质D17的含量，得到不同pH条件下，降解不同时间后D17的含量，结果如下：

[0046]

[0056]

[0057]

[0058]

注：pH为9.8时，开始有硫酸多黏菌素B沉淀析出，随着时间延长，析出硫酸多黏菌素B增多。

[0059]结果表明，未加氨水调节pH时，样品中杂质D17的含量在4小时内基本无变化；加入氨水后，在pH值9.8以下，随着pH值越大，相同时间内生成杂质D17的含量越多；pH为9.8或以上时，由于硫酸多黏菌素B沉淀不断析出，溶液状态下的硫酸多黏菌素B逐渐减少，降解产生杂质D17越来越缓慢。[0060]2、降解时间的影响

[0061]取5瓶分装的样品溶液，用氨水调节pH＝9.3，设定温度为33℃。分别在降解0h、4h、8h、24h、42h后取样进行高效液相检测，统计杂质D17的含量，结果如下：

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降解时间(h)0482442杂质D17含量(％)1.294.625.818.308.25[0063]结果表明，pH为9.3时，降解24小时后有硫酸多黏菌素B固体析出，随后杂质D17含量上升缓慢，则选取24小时为降解时间。[00]3、降解温度的影响

[0065]取3瓶分装的样品溶液，用氨水调节pH＝9.3，设定温度分别为：25℃、33℃、50℃，降解24h后取样进行高效液相检测，统计目标杂质的含量，结果如下：

[0066]

温度(℃)253350杂质D17含量(％)7.148.312.40[0067]结果表明，33℃条件下硫酸多黏菌素B降解产生的杂质D17含量最高。[0068]综上，在由硫酸多黏菌素B样品制备杂质D17时，加入氨水调节降解条件为pH＝9.3，在温度为33℃下降解24h产生杂质D17的含量最高。[0069]实施例4控制杂质D17含量的方法[0070]根据实施案例3，在进行硫酸多黏菌素B提取工艺中的沉淀步骤时，应一次性快速加碱至有硫酸多黏菌素B沉淀析出，硫酸多黏菌素B以固体形式存在可避免杂质D17的快速生成。

[0071]实施例5杂质D17作为标准品的应用[0072]取硫酸多黏菌素B粉末适量，精密称定，加稀释液(水∶乙腈＝8∶2)制成浓度为0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液；[0073]另取制备得到的杂质D17，精密称定，加上述稀释液制成浓度为0.005mg/ml的溶液，作为对照品溶液；

[0074]取对照品溶液10uL，注入液相色谱仪。检测条件同实施例3，记录色谱图；[0075]分别取对照品溶液和供试品溶液各10uL，注入液相色谱仪。检测条件同实施例3，记录色谱图。按外标法计算供试品中杂质D17的含量。[0076]硫酸多黏菌素B供试品为购自Fresenius和X-GEN pharm的硫酸多黏菌素B制剂，分别对其进行检测，结果如下表所示：

[0077]

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图1

图2

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图3

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