实验四固体纤维素酶滤纸酶活力（FPA）的测定方法

实验四固体纤维素酶滤纸酶活力(FPA)的测定方法 一目的

了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。 二、原理

纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 run测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。

酶活定义

以滤纸为底物，在一定反应条件（50℃，pH4.8，恒温1h）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。

三、试剂和溶液

(一) 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

1 DNS试剂

2柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶) 称取一水柠檬酸4.83 g,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000 mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。

注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g,溶于约750 ml,水中，加入乙酸2.31 ml,，用水定容至1 000 ml.调节溶液的pH到(4.8士0.1)备用

3葡萄糖标准贮备溶液（4mg/ml）

称取于(103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖4.0g,精确至0. 1 mg，用水溶解并定容至1000ml。（4mg/ml）

上述系列浓度应根据需要自行调整。

5快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。

(二) 仪器

除普通实验室仪器外，还应有: 1分光光度计

2酸度计精度10.01 pH 3恒温水浴(50士0.l)0C 4分析天平感量0.1 mg 5磁力搅拌器 6秒表或定时钟

7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)

8具塞刻度试管25 mL 四、操作步骤 4.1绘制标准曲线

按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(A.2.5)、缓冲溶液(A.2.2或A.2.3)和DNS试剂(A.2.1)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。

将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL.盖塞，混匀。用10 mm比色杯，在分光光度计波长540 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990以上时方可使用(否则须重做)。

表1葡萄糖标准曲线 管号

葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 mL

DNS试剂吸取量 mL

浓度4mg/mL 吸取量mg/mL

1 0.0 0.0 2.0 3.0 2 0.8 0.2 1.8 3.0 3 1.6 0. 4 1.6 3.0 4 2.4 0.6 1.4 3.0 5 3.2 0.8 1.2 3.0 6 4.0 1.0 1.0 3.0 4.2样品的测定 4.2. 1待测酶液的制备

称取固体酶样1 g,精确至0.1 mg(或吸取液体酶样1 mL，精确至0. 01 mL)，用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容50ml(使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内)，放置10 min，待测。

4. 2. 2滤纸条的准备

—将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:

—将水分平衡后的滤纸制成宽I cm、质量为(50+5)mg的滤纸条，折成M型备用。

4.3操作程序

—取四支25 mL刻度具塞试管(一支空白管，三支样品管)。 —将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部〔沿lcm方向竖直放入)。

—分别向四支管中，准确加入相应pH4.8的缓冲溶液( )1. 50 mL —分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中(空白管不加)，使管内溶液浸没滤纸，盖塞。

—将四支试管同时置于(50士0.1)℃水浴中，准确计时，反应60 min，取出。

—立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热10 min,取出，迅速冷却至室温，加水定容至25 mL,摇匀。

—以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540 nm下，用10 mm比色杯，分别测量三支平行管中样液的吸光度。取平均值。

以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

管号 底物（滤纸）

浓度mg 缓冲液吸取量 mL

酶液mL反应时间 DNS试剂吸取量 mL

7对照50 1.50.0 1h（加酶液0.5ml） 3.0 8 50 1.5 0.51h 3.0 9 50 1.50.51h 3.0 10 50 1.50.51h 3.0 4.4结果计算

X=Ax l/0.5xn·································· 式中:

X—样品的滤纸酶活力(FPA), u/g(或u/ml );

A—根据吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量mg; 1/0.5—换算成酶液1mg/ml; n 酶样的稀释倍数。 A.6允许差

同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10 %。变异系数不超过10%e