肌酐酶法检测试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109406798 A(43)申请公布日 2019.03.01

(21)申请号 201811266231.1(22)申请日 2018.10.29

(71)申请人 美康生物科技股份有限公司

地址 315104 浙江省宁波市鄞州区下应街

道启明南路299号(72)发明人 邹炳德　邹继华　章玉胜　贾江花　

汪屹　武强　(74)专利代理机构 宁波市鄞州甬致专利代理事

务所(普通合伙) 33228

代理人 沈春红(51)Int.Cl.

G01N 33/70(2006.01)G01N 33/3(2006.01)G01N 33/52(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图1页

()发明名称

肌酐酶法检测试剂盒(57)摘要

一种肌酐酶法检测试剂盒，该试剂包括试剂R1和试剂R2：试剂R1组成为缓冲液，肌酸酶，肌氨酸氧化酶，抗坏血酸氧化酶，胆红素氧化酶，TOOS，过氧化物酶，稳定剂，表面活性剂；试剂R2组成为缓冲液，4-氨基安替比林，肌酐酶，稳定剂，表面活性剂，抗菌防腐剂0.1-10g/L。能有效的降低毒性、以及降低对环境的污染，并且不容易引起细菌的耐药性，不会导致超级细菌的产生，降低对于人类的健康的风险，且稳定性好的肌酐酶法检测试剂盒，用于慢病管理的肌酐检测。

CN 109406798 ACN 109406798 A

权　利　要　求　书

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1.一种肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂R1和试剂R2：试剂R1组成为：缓冲液：10-100mmol/L，肌酸酶：1-100KU/L，肌氨酸氧化酶：1-200KU/L，抗坏血酸氧化酶：1-100KU/L，胆红素氧化酶：1-100KU/L，

TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)0.1-10mmol/L，过氧化物酶1-100KU/L，稳定剂1-50g/L，

表面活性剂0.1-1g/L，抗菌防腐剂0.1-10g/L；试剂R2组成为：缓冲液：10-100mmol/L，

4-氨基安替比林0.1-10mmol/L，肌酐酶1-1000KU/L，稳定剂1-50g/L，

表面活性剂0.1-1.0g/L，抗菌防腐剂0.1-10g/L。

2.根据权利要求1所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和试剂R2中所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液和MOPS中的几种或一种，且pH范围在7.0～8.8。

3.根据权利要求1所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和试剂R2中所述的表面活性剂为非离子性表面活性剂。

4.根据权利要求3所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和试剂R2中所述的表面活性剂为吐温系列、SPAN系列，TRITON系列中具体表面活性剂中的几种或一种，且浓度范围为0.1-1.0g/L。

5.根据权利要求1所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和试剂R2中所述的稳定剂为糖醇类或蛋白类物质。

6.根据权利要求5所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：所述的糖醇类包括蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、甘油、甘露醇、山梨醇的几种或一种，所述的蛋白类物质具体为BSA。

7.根据权利要求1所述的酶法肌酐检测试剂，其特征在于：试剂R1和试剂R2中所述的抗菌防腐剂为海洋生物抗菌肽。

8.根据权利要求7所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：所述的海洋生物抗菌肽为鲎类抗菌肽、贝类抗菌肽、虾类抗菌肽、鱼类抗菌肽和蟹类抗菌肽中的几种或一种，且浓度范围为0.1-10g/L。

9.根据权利要求1所述的肌酐酶法检测试剂盒，其特征在于：该试剂能用于慢病管理的肌酐检测领域。

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说　明　书肌酐酶法检测试剂盒

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技术领域：

[0001]本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用于慢病管理的肌酐检测试剂，更具体的为一种稳定的肌酐酶法检测试剂盒。

背景技术：

[0002]肌酐(CR)是人体肌肉代谢的产物，主要由肌酸通过不可逆的非酶脱水反应缓慢形成，再释放到血液中，随尿排泄，基本不受饮食和运动等影响，可通过肾小球滤过，在肾小管内很少会被再次吸收，肌酐包括血肌酐和尿肌酐，血肌酐衡量肾功能更有意义，血清肌酐浓度测定是评价肾小球滤过率的有效指标，可有效反映肾脏功能的实质损伤程度，在临床上检测有助于判断肾脏等病情具有重要意义。[0003]据报道，2013年城乡居民流行病学调查显示，中国慢性肾脏病(CKD)的总患病率为10.8％，推算中国有CKD患者近1.2亿。但是慢性肾脏病的知晓率仅为12.5％，同时慢性肾病后期的治疗方法难以奏效,患者预后以及生存质量也受到严重的影响,寻求一种能够在早期就能高度灵敏地、特异地反映肾功能损害的检测指标一直是当今临床不懈追求的目标。测量血清CR是一种直接的、早期的、灵敏的评估肾功能的重要指标,在临床上具有很长的发展历史。

[0004]CR临床检测常用的是苦味酸法和酶法，苦味酸法虽然试剂便宜，但线性范围窄，易受丙酮酸等其他物质的干扰，出现检测偏差，同时苦味酸本身具有爆炸性，在实际生产、运输过程中存在一定风险。酶法检测的原理是样本中的CR在肌酐酶的催化下水解生成肌酸，肌酸在肌酸酶作用下水解生成肌氨酸，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化生成甘氨酸、甲醛和H2O2，最后偶联Trinder反应，比色测定CR的浓度。酶法具有特异性高，线性范围宽、测定准确的优点，是目前市场上推荐的主流检测方法。[0005]根据国家的分级诊疗的逐步推广，慢病管理主要由基层医院，如社区医院、村卫生所等医疗机构承担，有利于降低患者的检测流程，降低患者检测时间和费用成本，有效提高慢病检测管理效率。目前CR普遍采用各种大型全自动生化分析仪检测，但由于设备价格高，且操作复杂，需要由经过专业培训的临床检验人员才可使用，占地面积大，维护费用高，需要专业人员定期保养，因此基层医疗机构或家庭个人都没有条件购买和使用。鉴于上述问题，目前市场上主要推广POCT等小型检测仪器用于基层医疗机构检测肌酐，从而实现对慢性肾脏病人的有效监测和预后管理。如美康生物科技股份有限公司生产的SMART小型自动生化仪。[0006]但是，小型自动生化仪等POCT仪器检测肌酐时，所用的肌酐试剂为单次分装检测试剂，而且用于基层医疗机构，在运输和储存过程中时间长，缺乏有效冷链条件，这对于试剂的稳定性提出的极高的要求。这不仅包括试剂相关成分的稳定性，同时也包括试剂在防腐和抗菌方面的稳定性。目前用于诊断试剂盒的抗菌防腐剂主要为化学类防腐剂和抗生素类防腐剂，但是化学类防腐剂存在着毒性大、环境污染等问题，抗生素类防腐剂容易引起细菌的耐药性，会导致超级细菌的产生，对于人类的健康具有极大的风险。鉴于此，开发稳定

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的肌酐酶法试剂，用于基层医疗机构用于慢性肾病管理，是亟待解决的问题。

发明内容：

[0007]本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能有效的降低毒性、以及降低对环境的污染，并且不容易引起细菌的耐药性，不会导致超级细菌的产生，降低对于人类的健康的风险，且稳定性好的肌酐酶法检测试剂盒，用于慢病管理的肌酐检测。[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种酶法肌酐检测试剂，该试剂包括

[0009]试剂R1和试剂R2：[0010]试剂R1组成为：[0011]缓冲液：10-100mmol/L，[0012]肌酸酶：1-100KU/L，[0013]肌氨酸氧化酶：1-200KU/L，[0014]抗坏血酸氧化酶：1-100KU/L，[0015]胆红素氧化酶：1-100KU/L，

[0016]TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)0.1-10mmol/L，[0017]过氧化物酶1-100KU/L，[0018]稳定剂1-50g/L，

[0019]表面活性剂0.1-1g/L，[0020]抗菌防腐剂0.1-10g/L；[0021]试剂R2组成为：[0022]缓冲液：10-100mmol/L，

[0023]4-氨基安替比林0.1-10mmol/L，[0024]肌酐酶1-1000KU/L，[0025]稳定剂1-50g/L，

[0026]表面活性剂0.1-1.0g/L，[0027]抗菌防腐剂0.1-10g/L。

[0028]试剂R1和试剂R2中所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液和MOPS中的几种或一种，且pH范围在7.0～8.8；即试剂R1和试剂R2中所述的缓冲液均可从上述缓冲液种类中选择使用，且两种试剂中的缓冲液pH范围在7.0～8.8。[0029]试剂R1和试剂R2中所述的表面活性剂为非离子性表面活性剂，如吐温系列、SPAN系列，TRITON系列中具体表面活性剂中的几种或一种，且浓度范围为0.1-1.0g/L。[0030]试剂R1和试剂R2中所述的稳定剂为糖醇类和蛋白类物质，具体为蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、甘油、甘露醇、山梨醇、BSA(牛血清白蛋白)的几种或一种，且浓度范围为1-50g/L。[0031]试剂R1和试剂R2中所述的抗菌防腐剂为海洋生物抗菌肽，为鲎类抗菌肽、贝类抗菌肽、虾类抗菌肽、鱼类抗菌肽和蟹类抗菌肽中的几种或一种，且浓度范围为0.1-10g/L。[0032]所述试剂的制备方法为将所述试剂成分按照配方比例加入蒸馏水后混合搅匀即可，为行业常规操作方法。

[0033]本发明采用的技术原理为：

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本试剂采用两步反应法，当样本加入到试剂R1中，肌酸酶和肌氨酸氧化酶可有效

去除血清内源肌酸的干扰，胆红素氧化酶去除胆红素干扰，抗坏血酸氧化酶去除抗坏血酸的干扰；当仪器自动混合加入试剂R2后，样本中的CR在肌酐酶的催化下水解生成肌酸，肌酸在肌酸酶作用下水解生成肌氨酸，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化生成甘氨酸、甲醛和H2O2，最后偶联Trinder反应，通过比色，并且通过与校准品比较，测定CR浓度。[0035]CR测定试剂的测试条件如下：温度：37℃；检测主波长：6nm，副波长700nm，样本加入量：10μl。

[0036]本发明中所述的抗菌防腐剂采用的海洋生物抗菌肽。据报道，抗菌肽由于其独特的抗菌机制，具有分子量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、广谱的杀菌作用、高效的抗菌活性等优点，被认为是新一代抗菌防腐剂，而体外诊断试剂和对于试剂的抗菌防腐性能要求极高，所以抗菌肽适合作为新一代的抗菌防腐制剂用于体外诊断试剂盒。[0037]本发明的优点和有益效果：

[0038]1.本发明的试剂采用抗菌肽作为抗菌防腐剂，结合稳定剂的使用，具有良好的抗菌防腐和抵抗热破坏效果，试剂在灵敏度高、准确度高、抗干扰能力强的基础上，稳定性极好，适合于慢病管理的肌酐检测。

[0039]2.本发明使用的抗菌肽是以海洋资源为原料，通过基因重组表达、蛋白分离纯化等技术研制的具有高效、广谱抗菌特性的新型抗菌肽，并且对于试剂盒的稳定性、灵敏度及试剂空白无影响；无毒，不会对人体和环境产生损害，也不使细菌产生抗药性，在液态试剂中有良好的溶解性和稳定性，因此本发明试剂盒添加抗菌肽可以有效溶解，在低浓度下既对试剂起到防腐抗菌作用，对于试剂具有良好的稳定作用。但抗菌肽本身是小分子多肽，缺乏完整的蛋白质胶体结构，本身稳定性差，易受高温、振荡等因素影响发生变性作用，其抗菌防腐性能伴随着变性作用也存在下降现象。而稳定剂作为糖醇类或蛋白类物质，对于小分子多肽具有保护作用，可以提高多肽的耐热，抗击振荡的变性作用，从而有效提高抗菌肽本身的稳定性，促使其发挥长效的抗菌防腐性能；同时稳定剂在试剂中对酶类等蛋白起到有效的保护作用，可以有效提高试剂对于热破坏的抵抗能力。另外，抗菌肽作为小分子蛋白，与酶类等高分子蛋白成分相互作用，也进一步有效地提高抗菌肽及试剂的储存稳定性。综上所述，本发明提出的抗菌防腐剂和稳定性的组合使用，有效提高了抗菌防腐剂的热稳定性，促其发挥长效的抑菌作用，同时也提高了试剂盒耐高温等稳定性，促其有效抵抗热破坏作用。两者协同作用，有效解决了肌酐试剂不稳定性问题。本申请创新性的提出了抗菌肽作为抗菌防腐剂，组合稳定剂的使用，并结合肌酐酶的具体试剂盒配方特点及其要求，完整地提出试剂盒的配方工艺，解决了肌酐试剂盒长期存在的稳定性问题。附图说明

[0040]图1：SMART IV与全自动生化分析仪测定的CR结果值比较图，其中X轴代表全自动生化分析仪日立7180测定结果，Y轴代表SMARTIV分析仪上测定结果。[0041]图2：以标准血清样品中添加不同浓度的CR进行检测的线性结果图。[0042]具体实施案例：

[0043]本发明通过以下实施例和验证试验对本发明的稳定的肌酐酶法检测试剂盒作进一步的说明。

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实施例1：

[0045]本实施例的肌酐酶法检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2构成，其中：[0046]试剂R1组成为：Tris缓冲液：20mmol/L，pH7.50；肌酸酶：20KU/L；肌氨酸氧化酶：15.2KU/L；抗坏血酸氧化酶：18KU/L；胆红素氧化酶：80KU/L；TOOS 2mmol/L；过氧化物酶40KU/L；BSA 20g/L；海藻糖10g/L；Tween20 0.3g/L；TgHb 1-5 0.5g/L。[0047]试剂R2组成为：Tris缓冲液：30mmol/L，pH7.80；4-氨基安替比林3mmol/L；肌酐酶400KU/L；BSA 5g/L；Tween80 0.3g/L；TgHb 1-5 0.4g/L。[0048]实施例2：

[0049]本实施例的肌酐酶法检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2构成，其中：[0050]试剂R1组成为：HEPES缓冲液：50mmol/L，pH8.0；肌酸酶：40KU/L；肌氨酸氧化酶：29KU/L；抗坏血酸氧化酶：50KU/L；胆红素氧化酶：40KU/L；TOOS 5mmol/L；过氧化物酶60KU/L；蔗糖10g/L；TritonX-100 0.2g/L；Aurelin 0.2g/L。[0051]试剂R2组成为：PIPES缓冲液：50mmol/L，pH8.2；4-氨基安替比林5mmol/L；肌酐酶600KU/L；果糖15g/L；TritonX-100 0.5g/L；Aurelin 0.8g/L。[0052]实施例3：

[0053]本实施例的肌酐酶法检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2构成，其中：[00]试剂R1组成为：MOPS缓冲液：30mmol/L，pH8.5；肌酸酶：62KU/L；肌氨酸氧化酶：35KU/L；抗坏血酸氧化酶：80KU/L；胆红素氧化酶：15KU/L；TOOS 6mmol/L；过氧化物酶45KU/L；甘油20g/L；SPAN20 0.1g/L；MCdef：0.6g/L。[0055]试剂R2组成为：MPOS缓冲液：50mmol/L，pH8.4；4-氨基安替比林6mmol/L；肌酐酶：700KU/L；甘露醇：10g/L；甘油:10g/l；SPAN20 0.21g/L；MCdef：0.4g/L。[0056]本发明中TgHb 1-5为泥蚶抗菌肽(贝类)，根据中国专利申请CN2017104041998制备而得，Aurelin为水母抗菌肽，根据中国专利申请CN2017104041983制备而得；MCdef为花蛤抗菌肽，根据中国专利申请CN20171040419制备而得；或者本发明中TgHb 1-5为泥蚶抗菌肽(贝类)，Aurelin为水母抗菌肽，MCdef为花蛤抗菌肽可分别根据王素芳等发表的《泥蚶血红蛋白的制备及其抗菌活性研究》《(海洋学报》2014年12期)，TV Ovchinnikova等发表的《Aurelin,a novel antimicrobial peptide from jellyfish Aurelia aurita with structural features of defensins and channel-blocking toxins》(《Biochem Biophys Res Commun》,2006年348卷2期)，M Adhya等发表的《Cloning and localization of MCdef,a defensin from Manila clams(Ruditapes philippinarum)》《(Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol》2012年161卷1期)制备获得。

[0057]下面对发明实施例1中的所得检测试剂的性能进行实验说明。[0058]1、准确度：

[0059]连续监测40份样本，将样本检测结果与全自动生化分析仪上测定的CR结果值进行比较，结果如图1，其中X轴代表全自动生化分析仪上测定数据，Y轴代表用于慢病管理的SMARTIV(由美康生物科技股份有限公司生产)上测定数据。据图1可知，拟合方程为：[0060]Y＝1.0088X+0.7249，相关系数R2为0.9994，表明两者相关性良好，SMART试剂测定结果准确度良好。[0061]2、精密度：

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对某两个样本连续进行20次测定，将测定结果进行精密度评估，结果见表1：表1：精密度实验结果

平均值(μmol/L)SD(μmol/L)CV

47.22.24.66％77.23.03.％

[0065]3、线性范围：

[0066]以标准血清样品外添加不同浓度的分析物进行检测，检测结果如图2，其中X轴代表全自动生化分析仪日立7180测定结果，Y轴代表SMARTIV分析仪上测定结果；据图2可知，拟合方程为：Y＝0.9835X+11.6，线性相关系数R2可达0.9996，表明SMART试剂在0-2000μmol/L范围内线性良好。[0067]4、储存稳定性：

[0068]将试剂放置于4℃下，分别于第3、6、9、12、15、18、21、24个月，测定质控品，并将测定结果与0个月测定结果进行比较，结果见表2：[0069]表2:4℃下，试剂检测稳定性结果

[0070]

月

质控品1(μmol/L)偏差(％)质控品2(μmol/L)偏差(％)

049.6 97.0 

349.2-0.8195.8-1.24

8.2-2.8295.4-1.65

947.2-4.8494.9-2.16

1249.5-0.2095.2-1.86

16.9-5.4494.3-2.78

1847.8-3.6395.0-2.06

2148.0-3.2393.8-3.30

2447.2-4.8493.2-3.92

样本12

将试剂放置于25℃下，分别于第7、14、21、28、35、49、63、77天，测定质控品，并将测

定结果与0天测定结果进行比较。结果见表3：[0072]表3:25℃下，试剂检测稳定性结果

[0071][0073]

[0074]

从上述实验结果可知，本发明试剂具有良好的准确度、精密度，良好的线性范围，在4℃储存下能够稳定24个月，在25℃储存下能够稳定77天，即11周，完全能够满足慢病管理的肌酐检测要求。[0076]5、抗菌防腐性能：

[0077]本发明为了进一步验证所发明的试剂盒对于热破坏的抵抗力和抗菌防腐性能，特

[0075]

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别是在试剂运输和储存受热影响后的抗菌防腐性能，做了如下实验：取试剂，分别直接加入一定浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，在37℃下，以20rpm(振荡幅度30mm)缓慢振荡7d后，加入一定浓度的大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，检测其受热破坏后的抗菌性能，并于市场上常见的肌酐检测试剂盒进行比较。结果见表4：[0078]表4：试剂受热破坏后抗菌性能结果

[0079]

从上述试验结果可知，本发明试剂具有良好的稳定性，不仅能够抵抗一定程度的热破坏，特别是在热破坏之后，对于常见的污染微生物，均具有良好的抗菌性能，充分表明本发明试剂在准确度高，线性范围广的基础上，具备良好的抵抗热破坏和抗菌防腐性能。[0081]以上所述实施案例，仅为本发明的个别实施例。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

[0080]

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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