第３９卷第４期 ２０１４年ｌ２月 广州化学 Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｂ１．３９ ＮＯ．４ Ｄｅｃ．２０１４ 文章编号：１００９—２２０Ｘ（２０１４）０４—００２２—０６ 昆仑雪菊中黄酮类化合物提取与纯化 王维维， 王亦军木， 侯圣龙， 焦焕风 （青岛大学化学科学与工程学院，山东青岛２６６０７１） 摘要：用超声法提取昆仑雪菊中黄酮类化合物，通过大孔树脂对提取液进行纯化，纯化物经聚酰胺 层析柱梯度洗脱得到初步分离物，通过颜色反应和紫外光谱扫描进行定性分析。设计正交实验得到超 声法提取的最佳工艺条件是６５％乙醇、料液比为１：４０、超声时间６０ ｍｉｎ，此条件下提取３次，总黄 酮得率可达１３２．６ ｍｇ／ｇ。通过聚酰胺柱层析法分离出五个组分，初步判断它们属于不同的黄酮类物质。 超声法提取总黄酮，提取率较高，聚酰胺树脂对黄酮类化合物的分离效果较好。 关键词：昆仑雪菊；黄酮类化合物；超声提取法；聚酰胺树脂 中图分类号：Ｒ２８４．２：Ｒ９２７．２ 文献标识码：Ａ 昆仑雪菊，学名为Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ，又名血菊、高山寒菊、金鸡菊，维吾尔语“古丽恰尔”Ｌ１ Ｊ，为 菊科金鸡菊属，主要分布在和田地区位于海拔３０００米左右的昆仑山北麓Ｌ２Ｊ。昆仑山地区的气候寒冷潮 湿，空气稀薄，生态环境十分独特，由于生态环境恶劣，昆仑山上的野生植物往往生命力很强，且都有极 高的药用价值Ｅ 。 昆仑雪菊中蛋白质和多糖的含量都远高于其他菊花品种，钙、铁、镁、锰等微量元素的含量也高于其 他菊花品种，有害元素铜、砷、铅、汞的含量则低于其他大部分菊花，氨基酸中含有其他菊花罕见的胱氨 酸，且甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸的含量也高于其他大多数品种，总黄酮的含量也远高于其他菊花品种Ｌ４Ｊ。 黄酮类化合物具有抗氧化、扩张冠状动脉一抗心肌缺血、降血压、抑制艾滋病毒、抗癌等生物活性和 药理作用ｐＪ。黄酮类化合物是药用菊花的主要有效成分，其含量高低也是评价菊花质量的重要标志【ｏＪ。 本文选用超声法提取昆仑雪菊中黄酮类化合物，再通过大孔树脂对提取液进行纯化，最后纯化物经聚 酰胺层析柱梯度洗脱得到初步分离物。设计正交实验得到了超声波法提取的最佳工艺条件。层析法分离出 五个组分，通过颜色反应和紫外光谱扫描进行定性分析，初步判断了它们的类别。超声法提取总黄酮，提 取率较高，聚酰胺树脂对黄酮类化合物的分离效果较好，为之后的结构鉴定奠定基础。 １ 实验 １．１仪器 ＱＺ７７．１０远红外辐射恒温干燥箱（青岛空调设备仪器厂），ＡＬｌ０４电子天平（梅特勒一托利多仪器有限 公司），ＡＳ５１５０超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），ＫＡ．１０００台式离心机（上海安宁科学仪 器厂），循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），Ｔ６新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用 有限公司），ＲＥ一５２Ａ型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），ＺＦ一２型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）。 收稿日期：２０１４．０７．０１ 作者简介：王维维（１９８９～），男，硕士研究生；主要从事天然产物分离分析的研究。 通讯作者：王亦军（１９５６～），女，教授，硕士生导师；主要从事分析化学和天然产物分离分析的研究。ｙｉｊｕｎｗａｎｇｑｄｕ＠１６３．ｃｏｍ 第４期 王维维等：昆仑雪菊中黄酮类化合物提取与纯化 ２３ １．２材料与试剂 昆仑雪菊，芦丁标准品，ＡＢ一８大孔树脂，柱层析用硅胶，聚酰胺（柱层析用），硅胶Ｇ（薄层色谱用）， 无水乙醇、亚钠、铝、氢氧化钠、氯化铝、甲醇等均为分析纯。 ２结果与讨论 ２．１黄酮类化合物的提取 ２．１．１供试样品溶液的制备 采用超声波法提取昆仑雪菊中的黄酮类化合物，考察超声时间、料液比、乙醇浓度三个因素对提取率 的影响，每个因素选取三个水平，如表１所示，设计正交实验选出最佳提取方案。每次称取０．５ ｇ干燥的 昆仑雪菊粉末，置于２５０ ｍＬ圆底烧瓶中，加入一定体积的乙醇溶液，置于超声波清洗器中超声相应的时 间，共提取３次，提取液全部转入１００ ｍＬ容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 表１超声波提取法考察的三因素三水平 ２．１．２芦丁标准使用液的配制 称取１２０℃干燥至恒重的芦丁标准品０．０４１ ｇ，置于５０ ｍＬ烧杯中，加入少量甲醇加热溶解，转入１００ ｍＬ 容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，作为芦丁标准贮备液（４１０￣ｔｇ／ｍＬ）。准确吸取１０ ｍＬ标准贮备液置于 ５０ ｍＬ容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为８２ ｇｇ／ｍＬ芦丁标准使用液。 ２．１‘３最大吸收波长的选择 准确称取芦丁标准使用液和样品使用液各５ ｍＬ，分别置于２５ ｍＬ容量瓶中，加蒸馏水５ ｍＬ，依次加 入５％的ＮａＮＯ２ １．０ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ；加入１０％的Ａ１ＮＯ３ １．０ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ；加入４％的ＮａＯＨ １０ ｍＬ，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置１５ ｍｉｎ后，以不加样品液为空白，在２００￣７００ ｎｍ波长范围内 扫描谱图。结果表明，两种溶液在３５２ ｎ／ｎ处均有较强吸收，故选择３５２ ｎｍ作为检测波长。 ２．１．４芦丁标准曲线的绘制［ 】 精密量取芦丁标准使用液０．０、１．０、２．０、３．０、４．０、 ５．０ ｍＬ分别加入到５０ ｍＬ容量瓶中，分别加蒸馏水 ５ ｍＬ，依次加入５％的ＮａＮＯ２ １．０ｍＬ，摇匀，静置６ｍｉｎ； 加入１０％的ＡＩＮＯ３ １．０ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ；加入 蘧 米 ４％的ＮａＯＨ １０．０ ｍＬ，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静 置１５ ｍｉｎ后，以不加芦丁为空白，在波长３５２ ｎｒｎ下测 定其吸光度值（如表２所示）。以浓度Ｃ（￣ｔｇ／ｍＬ）为 横坐标，吸光度 为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得 到线性回归方程：Ａ＝０．０３７ ８Ｃ＋０．０１９ ４，Ｒ ＝Ｏ．９９９ ４。 浓度ｃ／（ｇｇ．ｉｎＬ ） 表明芦丁标准液的浓度在１．６４～８．２０￣ｇ／ｍＬ范围内，吸 光度与浓度的线性关系良好，如图ｌ所示。 图１芦丁标准曲线 ２４ 广州化学 第３９卷 表２芦丁标准液浓度及其吸光度值 ２．１．５提取液中总黄酮含量的测定 准确吸取样品提取液１．０ ｍＬ置于１００ ｍＬ容量瓶中，以不加样品溶液为空白，按照“２．１．４”中的方法 测定其吸光度，根剧标准曲线得出提取液中总黄酮的含量，正交实验结果如表３所示。 表３ Ｌ９（３ ）正交实验结果 根据正交实验极差分析可知，乙醇浓度对黄酮提取率的影响最大，其次是超声时间，料液比对黄酮提 取率的影响最小。最优组合为Ａ２Ｂ２Ｃｌ，即超声时间６０ ｍｉｎ、料液比１：４０、６５％（ ）的乙醇，在此条件 下提取三次，按照“２．１．４”的方法计算黄酮得率，结果总黄酮提取量为１３２．６ ｍｇ／ｇ。 ２．２黄酮类化合物的分离 ２．２．１ ＡＢ一８大孔树脂对黄酮类化合物的纯化 ＡＢ ８大孔树脂一装柱一预处理一浸泡一倒入黄酮提取液一蒸馏水洗脱至无色－－＊７０％７，醇洗脱一收集， 减压浓缩备用。 第４期 王维维等：昆仑雪菊中黄酮类化合物提取与纯化 ２５ ２．２．２聚酰胺柱层析分离雪菊中黄酮类化合物【 】 聚酰胺一浸泡一装柱－－－￣Ｄ入纯化浓缩液一乙醇梯度洗脱（乙醇／水比例从０：１至ｌ：０）一收集一薄层 色谱检测一合并收集液一浓缩，干燥一甲醇溶解，定容至５０ ｍＬ。 ２．２＿３颜色反应［ 】 表４不同黄酮类化合物的颜色反应 取２０支１５ ｍＬ试管，分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ五组，每组四支，编号１．４，分别加入五个组分的甲醇溶 液１ ｍＬ，依次加入适量对应的显色试剂，观察并记录颜色变化，如表５。 表５五个组分的颜色反应 参考表４，通过分析比较五个组分在不同显色剂下的颜色反应，可初步判断它们属于五种不同的黄酮 类物质。 ２．２．４五个组分的紫外光谱扫描 黄酮、黄酮醇等多数黄酮类化合物，因分子中存在桂皮酰基（ｃｉｎｎａｍｏｙ１）及苯甲酰基（ｂｅｎｚｏｙ１）组成 的交叉共轭体系，故其甲醇溶液在２００￣４００ ｎｌＴｌ的区域内存在两个主要的紫外吸收带，成为峰带Ｉ（３００～ ４００ ｎｍ）及峰带ＩＩ（２２０￣２８０ ｎｍ）（如图２所示）。不同的黄酮类物质，其峰Ｉ和峰ＩＩ的位置及强度也不 相同（数据见表６）【 Ｊ。 Ｏ 苯甲酰基 （峰带ＩＩ，２２０￣２８０ ｎｍ） 黄酮（Ｒ＝Ｈ） 黄酮醇（Ｒ＝０Ｈ） 桂皮酰基 （峰带Ｉ，３００￣４００ｎｍ） 图２黄酮类化合物结构中的交叉共轭 ２６ 广州化学 第３９卷 表６不同黄酮类化合物的紫外吸收光谱 结构类型 峰带Ｉ／ｎｍ ３１０～３５Ｏ ３５０～３８５ 峰位 峰带ＩＩ／ｎｍ ２５０～２８０ ２５０～２８０ ２４５～２７５ 组内区别峰位 组间区别峰强 黄酮 黄酮醇 带Ｉ不同 Ｉ、ＩＩ皆强 异黄酮 二氢黄酮（醇） 查尔酮 橙酮 ３１０￣３３０（肩峰） ３００￣３３０（肩峰） ３４０￣３９０ ３８０～４３０ ２７５～２９５ 带ＩＩ不同 Ｉ弱ＩＩ强 ２３０￣２７０（低强度） ２３０￣２７０（低强度） 带Ｉ不同 Ｉ强ＩＩ弱 以甲醇溶液作空白，在２００￣７００ ｎｍ范围内扫描五个组分在甲醇溶液中的紫外光谱，谱图如图３和图 ４所示。 图３组分Ｉ～ＩＩＩ的紫外光谱 图４组分Ⅳ～Ｖ的紫外光谱 通过观察分析五个组分的紫外谱图，它们在波长２００￣４００ ｎ／ｉ１内均有两个不同的吸收峰，且吸收峰的 位置及强度均不同，如表７所示，可初步推断出它们分别属于五种不同的黄酮类物质。 表７五个组分百勺紫外光谱数据 ３ 结论 本文通过设计正交实验，得到了超声波法提取昆仑雪菊中黄酮类化合物的最优工艺，并利用ＡＢ．８大 孔树脂对提取液进行纯化，使用聚酰胺柱色谱，采用不同浓度乙醇梯度洗脱的方法，对雪菊提取液进行初 步分离，并通过颜色反应和紫外光谱进行定性分析，得出结论： １）超声波法提取昆仑雪菊中黄酮类化合物，最优方案是６５％的乙醇，料液比为ｌ：４０，单次超声６０ ｍｉｎ， 第４期 王维维等：昆仑雪菊中黄酮类化合物提取与纯化 ２７ 提取三次，总黄酮提取量可达１３２．６ ｍｇ／ｇ。 ２）采用聚酰胺柱层析法分离提取液，通过薄层色谱检测，共分离出五个黄酮组分。分别通过颜色反 应和紫外光谱扫描进行定性分析，初步判断出它们属于不同的黄酮类物质，组分１可能是二氢黄酮，组分 ２可能是查尔酮或橙酮，组分３可能是二氢黄酮或二氢黄酮醇，组分４可能是黄酮，组分５可能是查尔酮。 本文初步判断出每个组分的可能归属，还需进一步的纯化和其他结构鉴定才能最终确定其结构和类型。 参考文献： ［１］ 赵军，孙玉华，徐芳，等．昆仑雪菊黄酮类成分研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０１３，２５（１）：５０．５２． ［２］ 王艳，张彦丽，阿依吐伦。斯马义．分光光度法测定昆仑雪菊中总黄酮的含量［Ｊ］．医科大学学报，２０１１，３４（８）： ８ｌ７．８１９． ［３］ 热阳古．５可布拉，夏娜，木尼热‘阿不都克里木，等．昆仑雪菊总黄酮的提取及含量测定［Ｊ］．喀什师范学院报，２０１３，３４（３）：４５－４７． ［４】 兰卫，赵宝胜，李玉清，等．昆仑雪菊中多种成分的含量测定［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１２，１８（１０）：１０１—１０３． ［５】 郑大成，木合布力 阿布力孜，阿依努尔・吐鲁洪．昆仑雪菊水溶性黄酮的制备及初步鉴定［Ｊ】＿亚太传统医药，２０１０，６（１０）： １８．２０． ［６］ 买买提‘艾买提，木合布力‘阿布力孜，孟磊．昆仑雪菊水溶性总黄酮的含量测定［Ｊ］．海峡药学，２０１０，２２（１０）：５６—５８． ［７】 刘文辉，崔鸿江，王静峰．紫外可见分光光度法测定抱茎苦荬菜中总黄酮的含量［Ｊ］．内蒙古医学杂志，２０１０，４２（９）： １０４２．１０４４． 【８］ 刘汉文，陈洪兴，周立巧，等．超声微波协同提取花生壳中黄酮类化合物的研究［Ｊ］．盐城工学院学报（自然科学版）， ２０１３，２６（３）：６４－６８． ［９】 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ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｅｌｌ ｂｙ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ
