热带假丝酵母诱变菌株筛选的两步浓缩与影印技术

来源：年旅网

ISSN1000200清华大学学报(自然科学版)2000年第40卷第6期

CN1122223󰃗N.40,No.6JTsinghuaUniv(Sci&Tech),2000,Vol7󰃗34

2225

热带假丝酵母诱变菌株筛选的两步浓缩与影印技术3

焦　鹏,　马帅武,　黄英明,　沙,　曹竹安

(清华大学化学工程系,北京100084)

文　摘:为提高热带假丝酵母转化烷烃生产长链二元酸的能力,建立了通过两步浓缩和双重影印技术筛选获得Α、Ξ2氧化增强、2氧化减弱的热带假丝酵母诱变菌株的筛选体Β系。热带假丝酵母经过硫酸二乙酯和紫外诱变,其中的Β2氧化减弱或阻断的细胞在含有制霉菌素的SEL121培养基中得到浓缩(浓缩效率为8倍);Α、Ξ2氧化增强的突变株在含有氯丙嗪的YPD培养基中被进一步浓缩(浓缩效率为3倍)。此外,应用SEL1影印技术,Alk-突变株可以被快速地分离出来。在5×108个诱变处理的细胞中应用上述体系筛选获得了43株Β2氧化减弱或阻断的菌株。接着,通过SEL2影印技术,获得了10株Α、Ξ2氧化增强的突变株。

关键词:长链二元酸;热带假丝酵母;两步浓缩;双重影

印;Α、2氧化Ξ2氧化;Β

中图分类号:TQ920.1;Q93.97文章编号:1000200(2000)0620022204

文献标识码:A

程中[6,7],烷烃被吸收进入细胞后,首先经过细胞色素P450酶氧化生成Α2一元醇,再进一步被氧化生成Α2一元酸,这被称为Α2氧化。接着,Α2一元酸经过

同样的酶系催化,经过Ξ2氧化途径被氧化生成目标产物Α、、Ξ2二元酸。此外,在ΑΞ2氧化过程中生成的一元酸和二元酸都可以被肉毒碱酯酰转移酶(COT酶)转移进入微体中经过Β2氧化而代谢消耗掉。所以在假丝酵母细胞中Α、Ξ2氧化是一个需要增强的代谢途径,而Β2氧化是需要削弱的代谢途径。因而,建立一个能从大量的诱变的菌株中筛选出Α、Ξ2氧化增强而Β2氧化减弱菌株的高效筛选体系,对于假丝酵母菌株的改造以及长链二元酸的生产都有重要意义。应用两步浓缩和影印技术的筛选方法,可以高效率地获得目的菌株。

　　长链二元酸(dicarboxylicacid,DCA)是一种重

要的化工原料,是合成工程塑料、香料、耐寒性增塑剂、涂料、液晶等物质的重要原料。目前,人们主要通过热带假丝酵母代谢烷烃来生产从DCA11到DCA18等不同碳链长的二元酸

[1,2]

1　材　料

1.1　菌种

采用清华大学化学工程系生物化工研究所保藏的热带假丝酵母(Candidatropicalis)。1.2　培养基

1)SEL121培养基:NaH2PO4,0.2g󰃗L;K2HPO4,0.4g󰃗L;NaCl,1.0g󰃗L;(NH4)2SO4,5.0g󰃗L;正十三烷,30g󰃗L;pH=7.0;2)SEL122培养基:NaH2PO4,

0.2g󰃗L;

。

多年来在各种微生物,尤其是假丝酵母的烷烃

降解途径方面有大量的研究[3,4]。无论研究的目的是考察上述途径的生化和遗传特性还是利用它来获取有经济价值的中间产物,研究的关键是烷烃代谢途径发生突变的菌株。由于诱变菌株出现的频率极低,因此有必要建立高效的诱变菌株筛选技术。

在假丝酵母转化烷烃生成长链二元酸的代谢过

　　收稿日期:1999208226

　　作者简介:焦鹏(19722),男(满),内蒙古,博士后　3基金项目:国家“九五”科技攻关项目(962C03204202);

中国自然科学基金项目(29976022);中国博士后科学基金项目;中国石油化工总公司基础研究重点项目(x598022)

[5]

K2HPO4,0.4g󰃗L;NaCl,1.0g󰃗L;(NH4)2SO4,5.0g󰃗L;葡萄糖,20g󰃗L;pH=7.0;

3)YPD培养基:酵母膏,10g󰃗L;蛋白胨,20g󰃗L;葡萄糖,2g󰃗L;pH=7.0;4)SEL221培养基:蔗糖,30g󰃗L;Na2HPO4,2g󰃗L;KH2PO4,4g󰃗L;酵母膏,1g󰃗L;尿素,2g󰃗L;正十三烷,20g󰃗L;pH=7.5,加入1%～3%的8.3g󰃗L浓度的酚红;

5)SEL222培养基:维生素B1,0.1g󰃗L;酵母

焦　鹏,等:　热带假丝酵母诱变菌株筛选的两步浓缩与影印技术23

膏,1g󰃗L;尿素,2g󰃗L;正十三烷,20g󰃗L;pH=10.5,加入1%～3%的10g󰃗L浓度的百里香兰酚酞乙醇溶液。

两步浓缩,首先采用制霉菌素(nystatin)进行第一步浓缩。制霉菌素属于大环内脂类抗生素[6,8],可与真菌细胞膜上的甾醇作用,引起细胞膜的损伤,从而可以杀死正在生长繁殖的酵母和霉菌。

在烷烃(alkane,Alk)作为单一碳源的培养基中,非烷烃利用缺陷型菌株由于能够利用烷烃生长

2　实验方法

2.1　C.tropicalis细胞的化学诱变

应用硫酸二乙酯诱变热带假丝酵母。2.2　两步浓缩筛选

[7]

繁殖,从而被制霉菌素杀死;而烷烃利用缺陷型菌株(即Β2氧化阻断型)在烷烃单一碳源培养基中由于处于“休眠”状态存活下来。美国的Casey等曾采用制霉菌素进行Alk-菌株的筛选工作[6]。但我们在实验中发现,在采用制霉菌素进行第一步浓缩时,应用Casey所提出的培养液虽然可以使细胞的浓度降低第1步:制霉菌素浓缩Alk-热带假丝酵母:用

SEL121培养液悬浮2.1节中处理的细胞,加入制霉菌素至终浓度10mg󰃗L,处理60min,离心,用pH=7.0的0.1mol󰃗L的磷酸钠缓冲液重悬浮细胞;

第2步:紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩Α、Ξ2氧化增强的热带假丝酵母:细胞重悬液系列稀释102,103,104,105倍;从各不同的稀释菌液中吸取0.3mL涂于含有5mg󰃗L的氯丙嗪的YPD固体平板,以及不含氯丙嗪的YPD平板。以100～500

kJ󰃗mm的紫外线剂量处理上述平板,设置对照组。避光,30℃培养。2.3　双重影印技术

1)SEL1影印平板筛选获得Alk-热带假丝酵

约100倍以上,但其中的有效浓缩效果却很低。究其原因,他在利用烷烃作为碳源的同时,其中的一些有机氮源也可以作为碳源而被Alk-的菌株所利用,使经过诱变的菌株,无论是Alk+,还是Alk-,都可以在培养液中生长而被制霉菌素杀死。这样,Alk-在菌液中被同步浓缩,细胞的致死率很高,但Alk-所占的比率却依然没有升高。

由于上述原因,我们在SEL121的体系中进行浓缩,Alk-不能生长,只有Alk+可以生长而被杀死,从而实现Alk-的有效浓缩。

另外,我们又采用了氯丙嗪进行第二步浓缩。氯丙嗪是热带假丝酵母肉毒碱酯酰转移酶(COT酶)的抑制剂,可以起到毒害和杀灭热带假丝酵母细胞的作用[9]。细胞色素P450是酵母Α,Ξ2氧化途径中的关键酶,除了催化烷烃生成相应的一元醇以外,P450酶还可催化分解对细胞有毒的物质(如氯丙嗪)。细胞色素P450酶活较强的菌株由于其解毒能力强,在有氯丙嗪存在的条件下得以存活下来。,Ξ2氧化能力也较强,P450酶活强,反映酵母菌的Α

母:经过2.2节第2步中处理的平板,选择致死率

为50%～90%且在含有氯丙嗪的培养基的条件下获得生长的菌株,从上述获得的含氯丙嗪的YPD平板上用无菌牙签挑取单菌落,分别一一对应的点种于SEL121和SEL122固体平板上,培养。

2)Alk-热带假丝酵母的复筛:1)中处理的菌落,选择在SEL121平板上不生长,而在SEL122平板上生长的菌株,在SEL121平板上划线,培养,再次确认没有获得生长后,将菌株转移至YPD培养基活化并保藏。

3)SEL2系统筛选Α、Ξ2氧化增强的热带假丝酵母:经过2)复筛获得的菌株分别一一对应地接种于SEL221平板和SEL222平板,于30℃培养。

4)Α、Ξ2氧化增强的热带假丝酵母的获得:经过3)处理的菌株,测定不同菌株在SEL222平板上的

菌落面积),选择R值大R值(R=产酸圈的面积󰃗

的菌株作为目的菌株。另外,观察菌株的菌落在SEL221平板上的变色圈,选择其中显示黄色的菌株,并将其中显示黄色和R值大的菌株筛选出来。

从而浓缩得到Α,Ξ2氧化增强型的菌株。表1显示了

C.tropicalis经过诱变和浓缩后的试验结果。

表1　C.tropicalis经诱变和浓缩处理后的结果处　　理出发菌株硫酸二乙酯诱变

Nystatin浓缩

细胞浓度109󰃖L-1

21061150.310.11

致死率󰃗%

—

浓缩倍数3

——

—

3　结果与分析

3.1　热带假丝酵母的诱变及两步浓缩

紫外线诱变氯丙嗪浓缩

—

　　3浓缩倍数为试剂(Nystatin或氯丙嗪)处理前的细胞

浓度除以处理后的细胞浓度

针对烷烃在热带假丝酵母的代谢途径所设计的

清华大学学报(自然科学版)2000,40(6)

3.2　热带假丝酵母筛选的影印技术

通过两步浓缩,可以十分有效地使目的菌株富集起来,但是目的菌株的最终获得,还需使用影印平板技术。在第一重影印技术中,分别采用了以烷烃和葡萄糖为单一碳源的影印平板,从浓缩后的菌液中获得了43株不利用烷烃生长的菌株。影印平板的使用,可以同时处理数百以至于上千个菌株,极大地提高了筛选效率。通过制霉菌素处理的菌液,在经过影印平板筛选后,从5亿个处理的细胞中筛选出了43株目的菌株;而未经制霉菌素处理的菌液,只从5亿个处理的细胞中筛选出5株目的菌株,所以制霉菌素在SEL121体系中的有效浓缩效率为8倍。在表1所显示的制霉菌素的浓缩倍数是4倍,这个浓缩只表明经过制霉菌素处理后,存活细胞浓度降至原来浓度的1󰃗4。但实际上,经过制霉菌素处理后,菌体浓度不但会降低,而且其中Alk-细胞的相对百分率也得以提高。通过上述影印技术的检测,可以得出制霉菌素在SEL121的培养体系中的实际浓缩倍数为8倍。

筛选获得的Alk-菌株,再进行第二重影印。由于在SEL222平板中采用了高pH值的培养条件(pH=10.5),这样一方面细胞产生的二元酸可以有效地扩散,使产酸圈的大小能够直接反应产酸量的多少;另一方面,高pH值作为一个不利的环境因素,可以检测菌体的活力。此外,为了同步考察菌株在正常产酸条件下的产酸和生长情况,我们把SEL222上的菌株影印到SEL221平板上。SEL221培养基上的条件,就是通常菌体产酸时的条件(此

我们选择R>1.5的菌株作为进一步考察产酸能力的初筛菌株。产酸圈R>1.5的各突变菌株如表2中所示(出发菌株的R=1.43)。

表2　烷烃利用减弱型菌株以及烷烃利用

缺陷型菌株产酸圈R值

烷烃利用减弱型编号

2#出发菌株

1214121112121231271211213125122124

烷烃利用缺陷型编号

12122252293213521121032232112210

1.432.041.851.851.751.681.681.1.631.581.51

1.851.421.411.301.291.271.231.181.12

从上述实验结果可以看出在Β2氧化完全阻断的9株菌中,只有1212显示了较强的产酸特性,其R值为1.85,即只有11%的Β2氧化完全阻断的菌株显示了一定的产酸增强。而在剩下的34株Β2氧化减弱的菌株中,有10株菌显示了较强的产酸能力(R≤1.5),约占30%。由此也可以看出,Β2氧化完全阻断的菌株,通常会对菌株的生长产酸产生不利的影响。另外,从表2也可以看出,1212菌株是一个很有潜力的具有高转化率、高产酸能力的菌株,通过初步二元酸发酵实验表明,其产酸能力比出发的野生菌株提高到3倍以上。

时,二元酸在平板上不能有效扩散),结合SEL222上菌体的产酸圈,可以将其中的有高产酸能力菌株筛选出来。

在第二重筛选实验时,为了更加科学地检测菌体的产酸能力,采用计算菌体的R来衡量产酸能力。点种时接种量的不同常会造成点种菌体所形成的菌苔大小不同。R值的引入,消除了由此带来的影响。

3.3　热带假丝酵母诱变菌株经两步浓缩及影印技

4　结　论

通过上述结果表明,应用制霉菌素和氯丙嗪的两步浓缩以及SEL1和SEL2双重影印技术的方法,可以高效率的筛选得到十三碳二元酸产量高的初筛目的菌株。

术的初筛结果

　　5亿个诱变处理后的细胞,经过两步浓缩和影印技术筛选后,筛选出了43株不利用烷烃生长或生长减弱的正向突变菌株,其中包括9株完全不利用烷烃生长的菌株。这些菌株在SEL221平板上生长良好,根据SEL222平板上菌体的产酸圈R值大小,

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HUPingsha,CAOZhu’an

(DepartmentofChemicalEngineering,TsinghuaUniverstiy,Beijing100084,China)

Abstract:Thispaperdescribestwo2stepenrichmentanddouble2timereplicaplatingtechnologytoselectmutantswithenhancedΑ,Ξ2oxidationandblockedΒ2oxidation(Alk-).AfterC.tropicaliswasmutatedbyDESandultravioletlight,theAlk-mutantswereenriched(firststepenrichmenthadupto82foldinoneroundofenrichment)bytreatingwithnystatininmediumSEL121.ThenthemutagentreatedcellswereculturedinmediumYPDcontainingchorpromazinforfurtherenriching(thesecondstepenrichmenthadupto32foldinoneroundofenrichment)themutantswithincreasedΑ,Ξ2oxidation

-capacity.TheAlkmutantswerereadilyisolatedbySEL1replica2platingtechnology.Atotalof43Alk-mutantswereisolatedfrom5×108mutagen2treatedcells.Inthefollowingstep,SEL2replica2platingtechnologywasusedforscreeningstudiedwhichshowedthatofthe43Alk-mutants,10strainscouldrapidlyproduceDCAfromalkane.

Keywords:long2chaindicarboxylicacid;Candida

tropicalis;two2stepenrichment;double2timereplicaplating;Α,Ξ2oxidation;Β2oxidation

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